《Food Bioscience》：Substrate Channel Engineering of β-Glucosidase Enables Efficient Biocatalytic Production of Ginsenoside F1 with Enhanced Catalytic Performance and Thermal Stability
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摘要：稀有皂苷F1（G-F1）是一种天然丰度极低但具有高价值的生物活性化合物，在功能性食品领域备受追捧。β-葡萄糖苷酶可催化丰度高的人参皂苷Rg1（G-Rg1）转化为G-F1，但天然酶对体积庞大的底物催化活性较差，限制了其工业应用。本研究开发了一种多维理性设计策略，整合底物通
摘要：
稀有皂苷F1（G-F1）是一种天然丰度极低但具有高价值的生物活性化合物，在功能性食品领域备受追捧。β-葡萄糖苷酶可催化丰度高的人参皂苷Rg1（G-Rg1）转化为G-F1，但天然酶对体积庞大的底物催化活性较差，限制了其工业应用。本研究开发了一种多维理性设计策略，整合底物通道瓶颈分析、结合自由能分解和热点引导突变，对β-葡萄糖苷酶B6进行工程改造以提升催化活性。通过逐步组合突变通道瓶颈残基，获得了最优三重突变体M3（K75T/E329G/N334S），其对G-Rg1的催化效率显著提高，kcat/Km比野生型提高35.29倍，同时表现出增强的热稳定性（最适温度升高10°C，55°C下半衰期延长3.03倍）。分子动力学模拟揭示，这些改善源于通道拓宽、静电微环境重新分布以及结构刚性增强。在高底物生物转化条件下（20 g·L-1 G-Rg1，50°C），M3在5小时内实现了14.92 g·L-1的G-F1滴度，对应95.4%的底物转化率和较B6提高6.22倍的滴度。值得注意的是，M3在复杂的三七总皂苷提取物中对G-Rg1和NG-R1保持了双重专一性，并在粗酶条件下维持了稳健的催化活性。本研究提供了一种高性能生物催化剂，并证明底物通道工程是糖苷酶在食品生物加工改进中的可行途径。
引言
达玛烷型三萜皂苷是人参属药用植物的特征性生物活性成分，包括人参和三七，具有多种药理学活性（Riaz等，2019；Ruan等，2016）。其中，原人参三醇（PPT）型皂苷F1（G-F1）因其抗炎（Kim等，2021）、抗衰老（Hou等，2023）和胰岛素增敏作用（Meng等，2023）而备受关注，使其成为食品和营养保健品中有前景的功能性成分。然而，三七根中不含皂苷F1，仅在人参和三七的茎叶中以极低水平存在（Gao等，2022），这阻碍了其通过直接植物提取实现大规模供应（Chen等，2024；Kar等，2021）。因此，开发一种高效且可持续的G-F1生产途径仍然是一项重要挑战。
利用β-葡萄糖苷酶对丰度高的人参皂苷进行生物转化，为实现G-F1的可持续生产提供了一种有吸引力的替代方案。通过选择性水解人参皂苷Rg1（G-Rg1）的C6-O糖苷键，β-葡萄糖苷酶能够在温和反应条件下实现高度区域选择性的合成。Hu等（Hu等，2025）报道，重组β-葡萄糖苷酶BaBgl1A在优化条件下12小时内将2 mg·mL-1 G-Rg1转化为G-F1，转化率达98%。然而，大多数天然存在的β-葡萄糖苷酶对体积庞大的皂苷底物催化效率仍不足，限制了其工业应用。
蛋白质工程可进一步提升G-F1生产用糖苷酶的催化性能。计算机辅助修饰BglSK产生了T137A/L508A突变体，通过减少空间位阻和优化蛋白质构象，使其对G-Rg1的催化效率提高了13.88倍（Lin等，2024）。类似地，基于结构的BglDU工程改造产生了I73L/G138H/W509Y突变体。通过重塑底物通道，该变体实现了催化效率的提升和12.82 g·L-1的G-F1滴度（Sui等，2025）。与定向进化和半理性设计不同，后者需要构建和筛选大型突变体库，基于蛋白质结构信息的理性设计能够以显著减少的筛选变体数量实现靶向工程改造（Wei等，2024）。
目前大多数理性工程策略聚焦于催化残基或活性位点周围的残基。然而，这些残基是催化反应和底物识别的核心，在该区域引入的突变容易破坏催化网络，导致酶活性下降甚至完全丧失功能（Zhang等，2025）。与靶向活性中心附近残基的工程策略不同，底物通道代表了另一个有前景的修饰靶点。底物通道控制底物扩散、分子取向和产物释放，且在空间上与催化残基分离（Kokkonen等，2019），从而降低了破坏催化网络的风险。通道几何形状的调节可以在不直接干扰催化机制的情况下提升酶催化效率。然而，精确鉴定功能重要的通道残基仍然具有挑战性，因为底物运输由通道结构、残基相互作用和局部微环境共同控制。
本研究选择特异性水解G-Rg1生成G-F1的β-葡萄糖苷酶B6作为工程模板。与以往主要靶向活性位点口袋残基或依赖经验筛选的方法不同，我们开发了一种多维底物通道工程工作流程，整合了CAVER 3.0通道分析、MM-PBSA残基相互作用分析和HotSpot Wizard突变景观预测。该工作流程逐步精炼突变候选体，从通道瓶颈残基开始，逐步过渡到能量关键的相互作用残基。在所采用的分析工具中，基于MM-PBSA的结合能分解发挥了最重要的作用：它将CAVER预测的九个瓶颈残基筛选为四个关键相互作用位点，将实验筛选工作量减少了55%以上。随后精确定位有利的氨基酸替换，仅产生少量的设计变体。逐步组合突变最终产生了最优三重突变体M3（K75T/E329G/N334S），其表现出显著提高的催化效率和增强的热稳定性。为进一步评估其在食品生物加工中的实际应用潜力，该突变体在工业相关条件下（50°C）进行了测定，分别使用高浓度G-Rg1（20 g·L-1）和三七总皂苷作为底物。本研究提供了一种高效的G-F1生物合成稳健生物催化剂，并凸显了底物通道工程在调节糖苷酶对体积庞大食品来源天然产物催化性能方面的实用价值。
章节片段
菌株、质粒与试剂
大肠杆菌 Trans5α和BL21（DE3）菌株购自天根生化科技（北京，中国）。引物购自 Sangon Biotech（上海，中国）。NaCl、对硝基苯酚β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）和Tris均购自麦克林（上海，中国）。标准人参皂苷Rg1（G-Rg1，99%）和皂苷F1（G-F1，99%）购自上海远安生物科技有限公司（上海，中国）。三七总皂苷购自
通过CEHS策略鉴定突变热点
β-葡萄糖苷酶B6选择性水解G-Rg1的C6糖苷键，仅产生G-F1而不形成Rh1（图1A，B）。在我们先前的工作中（Sui等，2025），Asp327被鉴定为B6的关键亲核残基。在此，将经过验证的B6结构模型与G-Rg1进行对接。合理的复合物结构定义为Asp327的OD1原子与G-Rg1的异头碳之间的距离≤3 ?（Rohman等，2019）（图1C）。
对……的分析
结论
本研究证明，通过整合通道几何分析、结合能评估和热点引导突变的基于多维理性设计的底物通道工程，可有效提升β-葡萄糖苷酶B6的催化性能。通过系统替换底物通道内的瓶颈残基K75、E329和N334，我们实现了通道入口拓宽、静电环境重新分布以及结构刚性增强。这些
CRediT作者贡献声明
梁浩：撰写–审稿与编辑，监督，获取资金。康乙林：调查，形式分析。隋远儿：验证，形式分析。黄美兰：撰写–审稿与编辑。姚淑怡：方法学，调查。魏斌：撰写–审稿与编辑，方法学，调查。赵雅茹：撰写–审稿与编辑，撰写–初稿，方法学，调查，形式分析，概念构思
利益冲突声明
所有作者声明，我们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
利益冲突声明
? 作者声明，他们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
作者感谢国家重点研发计划（2021YFC2102800）和国家自然科学基金（22078014）以及NI-HPC Kelvin2高性能计算资源的资助
赵雅茹 | 魏斌 | 隋远儿 | 康乙林 | 姚淑怡 | 黄美兰 | 梁浩
