真空干盐腌豇豆发酵过程中挥发性化合物与非挥发性代谢物的时序重塑及VIP–OAV候选阶段标志物鉴定

《Food Chemistry: X》：Flavor development in vacuum dry-salted cowpeas: changes in volatile compounds and non-volatile metabolites during fermentation

　　

真空干盐腌豇豆（vacuum dry-salted cowpeas）表现出从青绿香（green notes）向发酵香（fermented aroma）的风味转变。C₆醛类（C₆ aldehydes）和醇类（alcohols）减少，而苯乙醇（phenylethyl alcohol）和4-乙基苯酚（4-ethylphenol）积累。基于变量投影重要性（VIP, variable importance in projection）—气味活性值（OAV, odor activity value）筛选，研究人员鉴定出11种与发酵阶段香气变化相关的挥发性化合物（volatiles）。代谢组学（metabolomics）将脂质（lipid）、氨基酸（amino acid）、肽（peptide）和苯环类（benzenoid）变化与风味前体（flavor precursor）周转联系起来。风味成熟（flavor maturation）涉及微生物演替（microbial succession）和前体转化（precursor conversion），而不仅限于酸化（acidification）。

豇豆（Vigna unguiculata L.）是中国广泛消费的重要豆类作物，其嫩荚含有氨基酸、膳食纤维、酚类化合物、黄酮类等营养成分，但采后易因失水、组织老化和微生物腐败而劣变。发酵可提高产品稳定性并延长货架期。酸豇豆是传统发酵蔬菜，其整体风味来自发酵过程中挥发性和非挥发性化合物的协同变化：醛、醇、酯、酮、酸、酚和杂环化合物直接贡献香气，有机酸、氨基酸、糖、肽和次级代谢物影响滋味并可作为风味前体。植物来源C₆醛和醇如hexanal、2-hexenal和(Z)-3-hexen-1-ol通常与青草、新鲜蔬菜样气味相关，而芳香醇、酯、有机酸和脂质衍生物常与发酵、花香、果香和酸香相关。传统蔬菜发酵如泡菜、酸菜、发酵萝卜通常以盐水浸泡进行，而真空干盐腌豇豆不同：盐直接与豇豆组织混合，真空密封，无外加盐水，液体逐渐从组织渗出，氧交换受限。这些条件可能影响微生物演替及碳水化合物、氨基酸和脂质向挥发性与非挥发性代谢物的转化。然而，真空干盐腌豇豆发酵中细菌和真菌演替、挥发性化合物与非挥发性代谢物之间的时间关系尚未系统研究。因此，研究人员旨在表征该发酵过程中挥发性化合物、非挥发性代谢物和微生物演替的时间演变，并筛选候选挥发性发酵阶段标志物，为过程监测和质量控制提供理论基础。

关键技术与样本来源：新鲜无损伤豇豆荚购自中国广西南宁当地市场，切段后与8%（w/w，相对鲜重）盐混合，真空密封，30 ± 2 °C避光发酵21天；采样点为SF₀、SF₃、SF₇、SF₁₄、SF₂₁，每个采样点3个生物学重复。技术主要包括理化指标分析、DNA提取后16S rRNA V3–V4和ITS扩增子测序及生物信息学分析、顶空固相微萃取结合气相色谱–质谱（HS-SPME-GC–MS, headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography–mass spectrometry）挥发性化合物分析、非靶向液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS, liquid chromatography–tandem mass spectrometry）代谢组学、KEGG通路富集分析，以及ANOVA、PCA、PLS-DA、OPLS-DA、PERMANOVA、Mantel、CCA和Spearman相关网络等统计分析。

3.1 豇豆发酵过程中的理化变化：pH由SF₀的5.94降至SF₁₄的3.46，SF₂₁回升至3.90；滴定酸（TA）由1.92 g/kg升至SF₁₄的7.62 g/kg；还原糖（RS）由1.92 g/100 g降至SF₂₁的0.10 g/100 g；氨基酸态氮（AAN）由0.87 g/100 g升至SF₁₄的2.18 g/100 g；亚硝酸盐（NT）在SF₃ transiently升至0.49 mg/kg，随后降至SF₂₁的0.22 mg/kg，低于中国限量20 mg/kg。研究表明真空干盐腌发酵促进酸化、碳水化合物消耗、氨基氮积累和亚硝酸盐降低。

3.2 微生物多样性与群落演替：3.2.1 α和β多样性显示，细菌Chao1总体升高，Simpson和Shannon先升后降；真菌多样性在SF₇最高。Jaccard PCoA显示各发酵阶段明显分离，PERMANOVA表明发酵阶段显著影响细菌（p = 0.001，R² = 0.611）和真菌（p = 0.001，R² = 0.499）群落结构。

3.2.2 细菌和真菌群落组成与演替：细菌门水平由Pseudomonadota向Bacillota替换，SF₀中Pseudomonadota占91.67%，SF₇中Bacillota占93.75%；属水平由Acinetobacter、Sphingomonas和Methylobacterium转向乳酸菌（LAB, lactic acid bacteria）主导，Lactiplantibacillus由SF₇的50.00%增至SF₂₁的66.67%，Weissella早期富集，Lactococcus中期较明显，Pediococcus持续至后期。真菌中Ascomycota增加、Basidiomycota减少；Plectosphaerella等SF₀较高后下降，Debaryomyces在SF₇达20.7%，Pichia和Millerozyma后期增加，Millerozyma在SF₂₁达8.8%。研究表明细菌群落逐渐重构为以Lactiplantibacillus为中心的LAB群落，真菌受盐、酸和密封环境选择。

3.3 挥发性化合物的动态变化：共检测95种挥发性化合物，包括14种醛、19种醇、17种酯、17种酮、5种酸、3种烃、3种含氮化合物、9种杂环化合物、3种醚和5种其他化合物。总挥发物由SF₀的2181.67 μg/kg降至SF₁₄的1298.88 μg/kg，再升至SF₂₁的2191.43 μg/kg。2-Hexenal和hexanal在SF₀分别为734.88和655.09 μg/kg，随后快速下降；(Z)-3-hexen-1-ol和1-hexanol也下降；phenylethyl alcohol在SF₂₁达272.42 μg/kg，占总挥发物约12.4%；linalool在SF₂₁达100.88 μg/kg，trans-linalool oxide仅在SF₂₁检测到。酯类总量由38.98 μg/kg增至SF₂₁的312.91 μg/kg，约8倍，hexadecanoic acid ethyl ester达159.67 μg/kg，acetic acid, 2-phenylethyl ester达58.80 μg/kg。4-Ethylphenol由SF₃的22.58 μg/kg急升至SF₇的619.13 μg/kg，SF₂₁达641.29 μg/kg，占总挥发物约29.3%。Acetic acid从SF₇出现并达41.13 μg/kg；3-octanone和1-octen-3-one早期较高后下降，6-methyl-5-hepten-2-one、1-hepten-3-one和acetoin后期出现或增加。研究表明挥发性轮廓由青绿香向发酵、花香、酚香、酸香和酮香转变。

3.4 与发酵阶段转变相关的候选挥发性标志物：PCA中PC1和PC2分别解释57.7%和25.3%，累计83.0%；PLS-DA分离与PCA一致并经置换检验。VIP > 1且p < 0.05筛出26种差异挥发物；OAV > 1有35种，包括10种醛、9种醇、6种酯、7种酮和3种杂环化合物；VIP与OAV交集得到11种候选发酵阶段挥发标志物。SF₀以2-hexenal、hexanal和(Z)-3-hexen-1-ol为特征，hexanal和2-hexenal的OAV由87.35和43.23降至SF₃后不可检测，(Z)-3-hexen-1-ol仅在SF₀检测，OAV为8.49。SF₃中(E)-2-heptenal、 (E)-2-octenal、(E,E)-2,4-heptadienal、1-octen-3-ol和1-octen-3-one达到峰值，OAV分别为246.12、122.18、14.96、43.20和4999.17。后期phenylethyl alcohol的OAV由SF₃的0.17升至SF₂₁的1.95；4-ethylphenol在SF₇、SF₁₄、SF₂₁的OAV分别为29.48、20.10和30.54。研究表明这些化合物可作为发酵阶段转变候选标志物，但4-ethylphenol感官贡献仍需GC–olfactometry和感官评价确认。

3.5 与风味前体池相关的非挥发性代谢物变化：非靶向LC–MS/MS检测到4257个注释特征，正离子模式2442个、负离子模式1815个；脂质和类脂分子占28.38%，有机杂环化合物18.31%，有机酸及衍生物18.00%，苯丙素和聚酮11.01%。PCA和PLS-DA显示阶段分离，前两个主成分解释总方差超过70%。相邻阶段OPLS-DA中Q²截距低于零，未显示明显过拟合；差异代谢物上调78–695个，下调129–440个；Venn分析仅2个差异代谢物在四个相邻比较中共有，提示代谢变化具有阶段特异性。

3.5.1 脂质和类脂分子：早期SF₃脂肪酸酰基和氧化脂质衍生物积累，与脂质衍生挥发物变化一致；中后期脂肪酸衍生物和甘油酯相关代谢物积累，LysoPCs逐渐下降，表明膜脂持续重塑。

3.5.2 有机酸及衍生物：D-(+)-phenyllactic acid和hydroxyphenyllactic acid主要在中后期积累，与乳酸菌芳香氨基酸代谢相关；肽类如γ-glutamylleucine和DL-leucyl-DL-phenylalanine在SF₇后逐渐积累，表明蛋白降解和肽周转持续进行。

3.5.3 有机杂环化合物与有机氧化合物：有机杂环化合物主要在中后期积累，包括indole、quinoline、quinoxaline、pyrrole和pyrazine相关化合物；有机氧化合物如碳水化合物相关代谢物、糖苷样化合物和酚苷在发酵后总体下降，与还原糖减少和酸度增加一致。

3.5.4 苯环类化合物：methyl benzoate在SF₀较高，发酵后明显下降；2,6-dihydroxybenzoic acid、gentisate和salicylic acid在中后期积累，与后期挥发性酚类化合物4-ethylphenol增加相吻合。

3.6 非挥发性代谢物变化的探索性通路分析：KEGG富集显示，SF₃ vs SF₀主要富集脂质相关代谢、核苷酸代谢及烟酸和烟酰胺代谢；SF₇ vs SF₃中丙酮酸代谢和支链氨基酸相关通路更突出；中后期苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢、支链氨基酸代谢、半乳糖代谢和丙酮酸代谢持续富集。整合通路表明代谢重塑主要围绕碳水化合物利用与酸化、氨基酸代谢与风味前体形成、脂质重塑与挥发性风味演变三个相互关联过程。

3.7 相关性分析：CCA和Mantel分析显示，SF₀样本接近pH和RS，后期样本接近TA、AAN和NT；细菌群落与pH、TA、RS和AAN显著相关，真菌群落也相关但酸化解耦更明显。Spearman网络在|R| > 0.85且p < 0.05时包含47个节点和82条边。Acinetobacter、Methylobacterium和Sphingomonas与(Z)-3-hexen-1-ol共变（R = 1.000）；Klebsiella与(E)-2-heptenal和(E)-2-octenal共变（R = 1.000和0.918）；Weissella与二者共变（R = 0.975和0.894）；Lactiplantibacillus与phenylethyl alcohol和4-ethylphenol共变（R = 1.000和0.900）。真菌中Plectosphaerella和Verticillium与phenylethyl alcohol和4-ethylphenol呈反向共变（R = ?1.000和?0.900）；Pichia与phenylethyl alcohol和α-isopropylmalate共变（R = 0.894）；Oligophagozyma与4-ethylphenol和Cer(d18:1/16:0)共变（R = 0.894）；Debaryomyces与D-erythro-sphingosine共变（R = 0.975），与dihydrolipoate和3-deoxyoctulosonic acid反向共变（R = ?0.975）。这些结果表明微生物演替与阶段性挥发物、脂质和氨基酸相关代谢物变化并行，而非直接因果关系。

讨论部分总结：真空干盐腌豇豆发酵是一种低游离盐水、直接加盐、液体逐渐释放、密封无外加盐水的体系。发酵改变理化性质，并促使原料相关青绿挥发物向芳香醇、酚类、酯、酸和酮富集的轮廓转变。早期微生物主要与绿色脂质衍生醛相关，后期Lactiplantibacillus和酵母类真菌与phenylethyl alcohol、4-ethylphenol及选定的氨基酸和脂质相关代谢物共变。候选标志物具有过程监测和产品一致性潜力，但因挥发物为半定量，仍需独立生产批次和加工条件验证，并需靶向定量、感官评价和接种实验确认标志物稳健性及微生物–化合物关系。

研究结论翻译：本研究对真空干盐腌豇豆发酵过程中微生物演替和风味相关化学变化进行了综合表征，该体系是一种独特的低游离盐水体系，涉及直接加盐、逐渐释放液体以及无外加盐水的密封发酵。发酵改变了理化性质，并促进了从原料相关青绿挥发性化合物向富含芳香醇、酚类化合物、酯类、酸类和酮类的轮廓的明显转变。在检测到的95种挥发性化合物中，11种被鉴定为发酵阶段转变的候选标志物。非靶向代谢组学进一步揭示了碳水化合物、有机酸、氨基酸、肽、苯环类和脂质相关代谢物的广泛重塑。相关性分析鉴定了微生物类群、挥发性化合物和非挥发性代谢物之间与阶段相关的共现模式。早期阶段微生物主要与绿色脂质衍生醛类相关，而后期Lactiplantibacillus和酵母类真菌与苯乙醇、4-乙基苯酚以及选定的氨基酸和脂质相关代谢物共变。这些发现建立了一个理解真空干盐腌发酵过程中风味演变的时间框架，并识别出对过程监测和产品一致性具有潜在价值的候选标志物。然而，由于挥发性化合物为半定量，需在独立生产批次和加工条件下进一步验证，以评估标志物稳健性并在实际应用前定义阶段特异性定量范围。需要进一步靶向定量、感官评价和接种实验来确认这些候选标志物和微生物–化合物关系。