《Food Chemistry: X》：Synergistic Alcalase-papain hydrolysis of egg white protein: enhancing structural unfolding, antioxidant activity, and gastrointestinal stability
编辑推荐：
食品来源生物活性肽因其超越基础营养的功能特性（包括抗氧化、抗高血压、抗炎及代谢调节活性）而受到广泛关注。蛋清蛋白（EWP）作为优质且来源丰富的蛋白质，是生产生物活性肽的理想前体。然而，天然EWP具有致密且高度有序的蛋白质结构，限制了蛋白酶的可及性，阻碍了低分子
食品来源生物活性肽因其超越基础营养的功能特性（包括抗氧化、抗高血压、抗炎及代谢调节活性）而受到广泛关注。蛋清蛋白（EWP）作为优质且来源丰富的蛋白质，是生产生物活性肽的理想前体。然而，天然EWP具有致密且高度有序的蛋白质结构，限制了蛋白酶的可及性，阻碍了低分子量肽的有效释放。本研究旨在评估单一蛋白酶水解与复合碱性蛋白酶-木瓜蛋白酶（Al-Pa）水解策略对EWP的差异化效应。研究结果显示，Al-Pa复合水解使肽得率提升至72.85%，其中63.71%为低于10 kDa的肽段，包括26.34%低于3 kDa的组分。结构分析表明，复合水解促进了蛋白质的广泛结构展开与重排，表现为表面疏水性（S0）显著升高、内源荧光发射最大波长红移至361 nm、β-转角结构占比增至86.44%以及扫描电镜（SEM）下球状形态与孔洞结构的形成。在延长模拟胃肠消化过程中，Al-Pa水解物持续保持较强的自由基清除活性，消化产物中疏水性氨基酸（HAAs）与支链氨基酸（BCAAs）浓度分别达183.61 ng/mL和79.41 ng/mL。研究人员（Researchers）的结论表明，复合Al-Pa水解策略通过协调肽段尺寸、分子结构与化学组成的协同变化，赋予水解物以消化稳定性与持续抗氧化功能，为开发面向老年及患病人群的功能性食品配料提供了理论依据。
一、研究背景与科学问题
食品来源生物活性肽因其超越基础营养的多种功能活性而备受关注，包括抗氧化、抗高血压、抗炎及代谢调节等作用。蛋清蛋白（EWP）作为一种优质且来源丰富的蛋白质，是制备生物活性肽的理想前体物质。然而，天然EWP具有致密且高度有序的蛋白质结构，这种结构限制了蛋白酶对底物的可及性，阻碍了低分子量肽段的高效释放。因此，开发一种能够提高肽得率并缓解长时间胃肠消化过程中活性损失的EWP高效水解策略显得尤为必要。
目前，碱性蛋白酶（Alcalase, Al）和木瓜蛋白酶（Papain, Pa）因高效性和安全性而被广泛应用，但单一蛋白酶受限于底物识别和可及性，难以达到预期功能效果。复合蛋白酶体系通过结合不同的催化与切割偏好，可靶向更广泛的肽键范围，从而提高水解效率并促进特定功能氨基酸的释放。已有研究表明，Al与Pa复合处理可提高鸡胸肉蛋白的肽含量和抗氧化活性，但该复合策略是否对EWP具有类似优势，以及由此产生的结构和肽谱变化如何在胃肠消化过程中影响功能特性，此前尚不清楚。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在比较单一蛋白酶水解与复合Al-Pa水解策略对EWP的水解效果差异。研究人员选择Al和Pa的依据在于二者特异性的互补：Al是一种丝氨酸内肽酶，切割特异性相对较窄；Pa是一种半胱氨酸蛋白酶，特异性更为广泛。研究从水解物得率、水解度、分子量分布、结构差异（包括傅里叶变换红外光谱FTIR、内源荧光光谱、扫描电镜SEM）、模拟胃肠消化过程中的抗氧化活性动态变化以及消化产物的氨基酸组成与功能特性等方面进行了系统解析。
研究结果表明，复合Al-Pa水解策略在EWP水解中具有显著优势。Al-Pa处理的肽得率达到72.85%，高于Pa（67.43%）和Al（63.77%）；低于10 kDa的肽段总比例达63.71%，其中低于3 kDa的组分占26.34%，均显著高于单一蛋白酶处理。结构分析显示，Al-Pa水解物发生了最广泛的结构展开与重排，表面疏水性（S0）最高，内源荧光最大发射波长红移至361 nm且强度显著降低，β-转角结构占比达86.44%，SEM下呈现球状形态并出现明显孔洞结构。在延长模拟胃肠消化过程中，Al-Pa水解物在各消化阶段均保持最高的DPPH自由基清除活性，ABTS活性也持续处于较强水平。消化产物中，Al-Pa组的支链氨基酸（BCAAs）和疏水性氨基酸（HAAs）浓度最高，分别为79.41 ng/mL和183.61 ng/mL，较EWP分别提高13.92%和4.90%。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术手段：利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Tricine-SDS-PAGE分析蛋白质与肽段的分子量分布；采用超滤分级（10 kDa和3 kDa截留膜）定量各分子量组分；使用Malvern Zeta Plus分析仪测定粒径和Zeta电位；采用荧光分光光度计（F-4600，Hitachi）测定内源荧光和表面疏水性；利用傅里叶变换红外光谱仪（Spectrum Two，PerkinElmer）结合PeakFit 4.12软件进行酰胺I带去卷积和高斯曲线拟合以估算二级结构组成；使用扫描电镜（S3400，Hitachi）观察表面形貌；采用改良的INFOGEST 2.0方案进行延长时间的体外模拟胃肠消化；通过邻苯二甲醛（OPA）法测定表观消化率（AD）；采用DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；使用自动氨基酸分析仪（LA8080，Hitachi）测定氨基酸组成。实验材料中，新鲜鸡蛋购自中国辽宁省大连市当地超市，Alcalase购自诺维信公司（北京），木瓜蛋白酶由上海源叶生物科技有限公司提供。
四、研究结果
3.1 水解物得率与分子量分布
凝胶电泳分析显示，未处理的EWP在29.0-64.4 kDa范围内呈现明显蛋白条带，对应卵清蛋白和溶菌酶。所有酶解处理均使44.3 kDa条带发生水解，并产生低于29 kDa的新条带。Tricine-SDS-PAGE进一步显示，复合蛋白酶处理产生的水解物分子量显著低于单一蛋白酶处理，产物主要由低于10 kDa的肽段组成。Al表现出比Pa更强的酶解能力，二者协同应用进一步提高了水解程度，产生了大量低于1.7 kDa的肽段。机理上，Al的初始处理破坏了EWP的可及区域并松散了天然结构，从而在后续水解过程中暴露更多肽键供Pa切割，有效拓宽了切割位点范围。得率与分子量分布结果进一步证实了复合处理的优势：Al-Pa得率最高达72.85%，低于10 kDa组分占比达63.71%，均显著高于单一蛋白酶处理。
3.2 结构特性分析
粒径与Zeta电位分析表明，酶解后EWHs的粒径增大，Al-Pa处理的粒径增加最为显著，同时所有酶解样品的Zeta电位绝对值均较天然EWP降低，Al-Pa处理的降低最为明显。这归因于水解诱导的组成变化增强了静电屏蔽效应，促进了短程吸引相互作用和聚集倾向。表面疏水性和内源荧光分析显示，酶解显著提高了EWHs的S0，Al-Pa水解物的S0最高。天然EWP的荧光发射最大波长位于334 nm，表明芳香族残基主要埋藏在疏水核心中；酶解后所有EWHs均出现发射波长红移和荧光强度降低，Al-Pa处理的位移最为显著（移至361 nm），表明水解产物中的荧光基团暴露于更极性的溶剂环境。FTIR分析显示，所有水解物在3000-2800 cm-1区域的吸收强度显著降低，表明酶解破坏了疏水结构域和维持二级结构所必需的氢键。酰胺I带去卷积拟合结果显示，天然EWP的二级结构组成为21.05% α-螺旋、51.60% β-折叠、12.18% β-转角、15.17% 无规卷曲；Al-Pa处理后β-转角相关组分占主导（86.44%），α-螺旋和无规卷曲组分变得极小或不可检测。SEM观察显示，单一酶解使厚块状结构转变为更薄的片状结构，表面出现碎裂和粗糙的多层颗粒聚集体；Al-Pa处理则呈现明显的球状形态，出现显著的孔洞结构，表明更广泛的蛋白水解降解。
3.3 体外消化过程中的性能变化
表观消化率测定显示，消化前Al-Pa处理的游离氨基初始水平最高（78.64%），表明复合蛋白酶切割肽键的效率更高。胃期和肠期出现最显著的增加，归因于低pH与胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶的协同作用。所有样品最终达到相近的AD值，表明消化进行至完成。抗氧化活性方面，Al-Pa水解物在各消化阶段均保持最高的DPPH自由基清除活性，其次为Pa、Al和未处理EWP。虽然消化过程中DPPH响应的绝对值发生变化，但Al-Pa的相对优势得以保持，表明复合水解产生的抗氧化功能未被后续消化性蛋白水解所消除。ABTS实验中，Al和Al-Pa来源的样品在整个消化过程中均保持较强的清除能力，其高活性源于含硫残基和酪氨酸相关酚基等供电子基团的暴露增加。氨基酸组成分析显示，与EWP消化物相比，酶解处理消化物中丙氨酸（Ala）、异亮氨酸（Ile）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）和亮氨酸（Leu）水平较高，而苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）和色氨酸（Trp）水平较低。Al-Pa组的BCAAs（79.41 ng/mL）和HAAs（183.61 ng/mL）平均浓度最高，较EWP分别提高13.92%和4.90%。芳香族氨基酸（AAAs）、必需氨基酸（EAAs）和总氨基酸（TAAs）在各处理间无显著差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，复合Al-Pa水解的优势不仅源于更高的水解程度，更源于肽段尺寸、分子结构和化学组成的协调变化。Al-Pa消化物中较高的Cys和Met水平以及更高的HAA浓度，为自由基清除反应提供了有利的氨基酸环境，这与观察到的更强DPPH清除活性和持续ABTS活性相关。然而，抗氧化性能还取决于肽段大小、序列和残基可及性，仅凭组成数据无法确定单个氨基酸基团的贡献。
研究结论表明，复合Al-Pa水解是增强EWP结构可及性和持续抗氧化功能的有效策略。与单一蛋白酶处理相比，复合蛋白酶促进了更广泛的蛋白质切割，产生了更高比例的低分子量肽段，并诱导了显著的结构重排。重要的是，Al-Pa水解物在延长模拟胃肠消化过程中保持了较强的抗氧化活性，表明水解过程中产生的功能特性对后续消化性蛋白水解具有相对抗性。消化后HAAs和BCAAs的富集进一步支持了这种持续活性的组成基础。这些发现建立了清晰的结构-组成-功能关系，凸显了复合水解作为开发具有改善消化稳定性的EWP衍生功能配料的可行途径。未来研究应鉴定关键生物活性肽序列，并验证其在体内的生物利用度和生理功效。
