大型土壤样本用于大型土壤生物：改良eDNA提取方法以研究土壤无脊椎动物群落

《European Journal of Soil Biology》：Large soil samples for large soil organisms – modification of eDNA extraction method for investigation of soil invertebrate communities

　　

摘要

尽管土壤环境DNA（eDNA）宏条形码技术已广泛应用于应用研究和基础研究，但该方法仍需对现有流程进行优化。尤其值得注意的是，大多数研究在DNA提取时仅使用0.2至1.0克土壤，这对于全面评估土壤无脊椎动物群落而言是不够的。此外，eDNA宏条形码技术无法提供可靠的土壤动物丰度数据。本研究首先对大体积土壤样本进行DNA提取前的预处理方案进行了改进。主要改进包括：将磷酸盐裂解缓冲液处理与在硝酸纤维素膜上浓缩提取DNA相结合的操作步骤，从而能够通过标准商业试剂盒完成最终纯化。其次，我们在一系列分析的土壤样本中，基于物种出现的频率和相对读取丰度，测试了通过宏条形码评估土壤动物丰度的可行性。我们发现，在温带云杉林的土壤中，所开发的预处理方法可检测到比商业DNA提取试剂盒多2至2.5倍的无脊椎动物属，而单细胞真核生物的多样性在不同提取方法之间没有显著差异。对于大多数无脊椎动物类群而言，eDNA宏条形码技术所揭示的多样性高于传统的形态学鉴定。然而，皮螨目和中垫螨目螨虫的多样性被低估了。我们还发现，对于大多数研究的类群，出现频率与通过形态学鉴定估算的动物丰度之间存在相关性。但这种相关性仅在从10克土壤中提取DNA的样本中被检测到。所提出的方法能够实现更具代表性的土壤无脊椎动物多样性评估，并为一系列类群提供定量丰度数据。增加处理土壤样本体积的能力有望识别出更多大型或稀有物种的多样性，这在大规模生物多样性监测项目中尤为重要。

引言

环境DNA（eDNA）宏条形码技术是评估生态系统生物多样性的有力工具。该方法从环境样本（如水、沉积物、空气和土壤）中提取DNA，并对短条形码区域进行高通量测序。它已在大规模生物多样性监测项目中得到广泛应用，也广泛应用于生态学研究中。提取的DNA通常以两种形式存在：存在于生物体细胞内的细胞内DNA，以及吸附在固体颗粒表面或以溶解状态存在的环境DNA。吸附在固体颗粒上的DNA非常稳定，可长期存在。这使得我们能够在样本采集时获取对不在样本中的大型生物体的多样性信息。使用不同的引物和条形码基因（如18S、COI、16S、ITS）可以获取整个生物群落从细菌到大型哺乳动物的分类组成信息。该方法对于研究土壤生物多样性尤为重要。无脊椎动物是土壤生物群落的关键组成部分，其体型范围广泛（从不到一毫米到数厘米不等），具有隐蔽的生活方式，且具有复杂的鉴定特征。因此，研究整个土壤动物群落需要应用多种不同的方法将动物从土壤中分离出来，需要大量专家参与鉴定，且非常耗时。eDNA宏条形码技术的发展极大地简化了这类研究，并使得使用标准化方法开展全球生物多样性评估成为可能。

尽管该方法应用广泛，但存在若干显著局限性。其中一个关键问题是用于DNA提取的土壤质量。土壤中含有高浓度的化合物（如有机酸），会抑制PCR中使用的聚合酶活性。因此，已开发出多种商业试剂盒用于从土壤中提取DNA，包括去除有机酸物质的试剂。这些试剂盒主要用于研究微生物群落，通常建议处理的最大土壤质量不超过0.2至1克。在这些小体积土壤中，不同大小的生物体所具有的eDNA形态（细胞内/细胞外）和数量存在差异。生物的丰度与其体型大小成反比。微生物群落的密度可达每克土壤10?至101?个细胞。在处理如此小体积的土壤样本时，细胞内DNA和细胞外DNA均被共提取，这似乎足以提供充分的遗传物质来代表性地评估微生物多样性。相比之下，多细胞生物占据更大的土壤体积，在使用小体积土壤样本时，检测到其活细胞的可能性较低，因为它们的eDNA通常来源于细胞外来源，且可能被片段化和降解。因此，在标准试剂盒处理的小体积土壤样本中，动物eDNA的绝对量通常过低，难以对其多样性进行代表性评估。

使用更大的土壤样本能够比使用不到1克土壤的标准试剂盒检测到更多的土壤动物类群多样性。遗憾的是，目前唯一一种针对大体积土壤样本优化的商业试剂盒（PowerMax? Soil DNA Isolation Kit）仅适用于8至10克土壤，且价格昂贵。研究人员已开发出从大体积土壤样本中提取DNA的替代方案。许多研究采用了包括使用弱碱性缓冲液进行初步样本处理的步骤的方案。在此处理过程中，DNA从土壤颗粒的带负电表面脱附，促使其转变为溶解状态。随后，含有脱附DNA的超滤液被用作标准商业试剂盒进行DNA纯化的起始材料，从而绕过了样本质量限制。尽管这种方法检测到的真核生物读数比PowerMax商业试剂盒少约1.2倍，但与专为0.5克土壤设计的DNA提取试剂盒相比，它在估算线虫α多样性和β多样性方面提供了更具代表性的结果。使用0.12M磷酸盐缓冲液（PBS）已被广泛用于聚焦于土壤无脊椎动物的研究中，用于脱附细胞外DNA。部分研究人员还额外使用了裂解剂，将细胞内DNA纳入分析。该方案的可扩展性使其能够处理传统分子方法无法管理的样本量，如1700克土壤。Lopes等人（2021年）对该方案进行了重大改进。他们将通过硝酸纤维素滤膜过滤含有脱附DNA、组织和细胞的超滤液，随后使用滤膜进行DNA提取。这种方法可以分析更大体积的含eDNA缓冲液。过滤技术常用于水eDNA分析，其原理是DNA、细胞和小型生物体会被截留在滤膜上。增加所分析的溶解DNA量可以显著提高土壤动物多样性的检测能力。然而，据我们所知，该方法仅被应用于分析植物凋落物的真核生物群落。

eDNA宏条形码技术的一个重要局限性在于缺乏关于检测到生物体数量和生物量的可靠数据。相对读取丰度（RRA）通常被用作丰度的替代指标。然而，这种估算受到DNA提取效率、引物对不同分类群的选择性、每个细胞基因拷贝数的变化以及组成一个生物体的细胞数量差异等因素的影响，同时不同生活方式的生物体产生eDNA的速率也不同。这严重削弱了定量丰度估算的可靠性，使得该指标在很大程度上具有半定量性质。一项荟萃分析表明，生物量与产生的序列数量之间仅有微弱相关性。另一种可能的参数是物种出现频率（FOO，即含有某一特定分类群的样本百分比），即在一系列通过eDNA宏条形码分析的样本中。由于该指标不依赖于获得的读数数量，它对分子技术操作细节相关错误的敏感性较低。该方法通常应用于分析动物的饮食偏好，但未用于评估土壤动物的丰度。据我们所知，在唯一的研究中，跳虫、蚂蚁和白蚁的出现频率与丰度之间未发现相关性。

因此，本研究旨在改进土壤eDNA宏条形码技术方法，以获取用于研究土壤无脊椎动物群落的定量和定性数据。为实现这一目标，我们在东欧平原温带云杉林中按规则网格采集了16个样本，提取了可恢复的总DNA。提取使用了专为0.5克和10克土壤设计的商业试剂盒，以及针对10克样本的Lopes等人（2021年）的改进过滤方案。关键改进涉及改变用于处理样本以进行总DNA提取的溶液组成。为验证宏条形码结果并研究出现频率与丰度之间的关系，我们使用传统的形态学鉴定方法评估了主要土壤动物类群的丰度。

我们假设：1）改进后的土壤DNA提取方案对无脊椎动物（线虫、蛛形纲、六足动物和环节动物）的检测效率将与PowerMax试剂盒相当，并优于传统的0.5克提取方法。然而，单细胞生物的检测效率可能不会因土壤样本量而受到影响。2）使用传统形态学鉴定估算的土壤无脊椎动物丰度与它们在eDNA样本中的出现频率之间存在相关性。

分段摘要

土壤采样

土壤采样于2023年7月在俄罗斯莫斯科州马林卡生物站的云杉-榛树林中进行（俄罗斯科学院森林生态研究所马林卡生物站；北纬55.4575°，东经37.1803°）。使用钢勺从0至5厘米深度采集了16份不含凋落物的土壤样本（每份样本约50克湿土）用于eDNA分析。每次采样后，用漂白剂对勺子进行灭菌，并在燃烧酒精的火焰中灼烧。样本沿规则网格（4×4）采集，样本间间距为5米。

结果

对48个样本（三种方法各16个样本，分别为Magen、PowerMax和过滤法）进行测序后，COI基因获得26,702,726条原始序列，18S基因获得9,834,024条原始序列。经过滤、合并、去冗余和嵌合体去除后，COI和18S rDNA基因分别获得57,439个和55,435个精确扩增子序列变体（ASV）。经鉴定和等级特异性相似性过滤后，COI ASV形成了包含122个物种的161个数据集。

讨论

环境DNA宏条形码技术具有显著扩展生物多样性评估中使用的生物体范围的潜力。使用多个标记基因可以分析整个生物群落，从微生物到脊椎动物和植物。这促进了不同生物体之间相互作用的研究，以及生物多样性与生态系统生态功能之间间接联系的识别。然而，标准DNA

结论

我们改进了土壤样本的预处理方法，用于从土壤样本中提取无脊椎动物DNA。该方法的核心原理包括：DNA从土壤颗粒上的脱附、从裂解细胞中释放细胞内DNA，以及通过真空过滤将产生的总DNA浓缩在硝酸纤维素滤膜上。所开发的方案显著提高了检测到的无脊椎动物多样性，并增强了结果的稳健性。该方法的运用

CRediT作者贡献声明

I.V. Sotnikov：撰写初稿、可视化、方法学、调查研究、形式化分析。E.S. Gusev：方法学、调查研究、形式化分析、概念设计。B.D. Efeykin：资金获取。A.Y. Korotkevich：验证、形式化分析。M.G. Krivosheina：验证、形式化分析。V.D. Leonov：验证、形式化分析。N.A. Martynenko：方法学、形式化分析。O.L. Makarova：验证、形式化分析。S.V. Naidenko：监督、资金获取。L.B. Rybalov

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本论文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究在国家委托项目（俄罗斯科学院A.N.谢维特索夫生态与进化研究所任务编号№ FFER-2024-0024）的资助下完成。感谢Ivan D. Tsvelev在实地工作方面的协助，以及Jacob Wickham博士（俄罗斯科学院A.N.谢维特索夫生态与进化研究所）在稿件英文润色和校对方面的帮助。

I.V. Sotnikov | E.S. Gusev | B.D. Efeykin | A.Y. Korotkevich | M.G. Krivosheina | V.D. Leonov | N.A. Martynenko | O.L. Makarova | S.V. Naidenko | L.B. Rybalov | A.V. Tanasevitch | A.V. Tiunov