高活性组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）去甲基化酶抑制剂的发现与设计用于炎症性肠病治疗

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design and discovery of highly potent lysine 27 of histone H3 (H3K27) demethylase inhibitors for the treatment of inflammatory bowel disease

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  对GSK-J4进行了系统的构效关系（SAR）研究。
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  化合物39显示出对赖氨酸特异性去甲基化酶6A/B（KDM6A/B）的强效抑制作用，并在细胞实验中表现出良好的安全性指数。
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  化合物39在M1巨噬细胞中强效抑制了促炎细胞因子的表达。
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  化合物39显示出比GSK-J4显著更强的体内抗炎活性。

引言

炎症性肠病（IBD）是一种目前无法治愈的胃肠道慢性炎症性疾病，其特征是免疫应答失调和组织持续性损伤[1], [2], [3]。该病影响全球数百万人，是结直肠癌的主要危险因素[4], [5]。尽管生物制剂和小分子药物取得了进展，但现有疗法往往难以诱导持续缓解，且伴有显著副作用[6]。越来越多的证据表明，免疫细胞中的表观遗传失调在IBD发病机制中起着重要作用[7], [8]。赖氨酸特异性去甲基化酶6A（KDM6A）和赖氨酸特异性去甲基化酶6B（KDM6B）是密切相关的表观遗传调控因子，共享一个保守的JmjC催化结构域，能够去甲基化组蛋白H3上的二甲基化和三甲基化赖氨酸27（H3K27me2/3）[9], [10]。这种酶活性调节染色质结构并解除炎症相关靶基因的转录抑制，导致IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子上调[11], [12]。研究表明，T细胞特异性敲除KDM6A可减少促结肠炎的CD4⁺ T细胞扩增，从而缓解IBD[13]。此外，IBD患者中KDM6B活性显著升高，其水平与临床疾病严重程度显著相关[14]。使用GSK-J4抑制KDM6B或通过基因敲低可降低巨噬细胞炎症小体活化，从而减轻肠道炎症[15]。总之，药理学抑制KDM6家族去甲基化酶已成为IBD中抑制炎症基因表达的潜在策略[13], [15], [16], [17]。

尽管具有这种治疗潜力，但开发强效、高选择性且真正具有细胞活性的KDM6A/B抑制剂的进展仍受到限制[18]。迄今为止，尚无KDM6A/B抑制剂进入临床开发的报告。2012年，Kruidenier等人报道了首个选择性催化位点KDM6A/B催化位点抑制剂GSK-J1（化合物1，图1），其针对KDM6B的IC₅₀值为28 nM。然而，GSK-J1在细胞实验中的效力较差，IC₅₀为17 μM。为克服酸性活性形式细胞渗透性差导致的细胞活性不足问题，采用了前药策略，得到GSK-J4（2），其细胞作用有所改善，但细胞效力仍不够理想，并且存在酯水解相关缺陷以及JmjC家族选择性问题[19], [20]。随后Xiong等人的结构优化提供了具有增强代谢稳定性的化合物3[21]。Jiang等人开发了化合物4作为KDM6B/HDAC双重抑制剂，在5 μM下对KDM6B的抑制率为94.5%[22]。Xiao等人报道了从筛选中鉴定的化合物5，其对KDM6B酶活性的IC₅₀为1.8 μM；然而，其细胞活性尚未评估[23]。除了这些早期工具分子外，这些抑制剂的进一步结构多样化和全面的药理学表征仍然有限。因此，仍迫切需要具有强效细胞活性的分子。

为克服这些局限性，我们对GSK-J4（2）及其水解活性酸的结构进行了全面的构效关系研究（SAR），系统地优化了多个结构部分，如图1B所示。具体而言，将苯氮杂环庚烷环替换为螺环和桥环体系以探索疏水相互作用。同时，通过用各种酰胺基团替换原来位于2位上的吡啶（或吡唑），对中心嘧啶核心进行了研究，这种修改旨在降低整体分子刚性，从而改善溶解度和细胞渗透性等理化性质。此外，改变了氨基烷基连接链的长度和空间位阻，以研究连接链性质对细胞活性的影响。最后，用包括磺酰胺和氟乙酰胺基团在内的生物电子等排体修饰了羧酸部分。通过这种方法，鉴定出化合物39作为强效且高选择性的KDM6A/B抑制剂，具有显著改善的细胞效力（EC₅₀ = 0.37 μM）和良好的安全性指数（SI = 25.27）。在药理学方面，化合物39有效抑制了M1巨噬细胞中多种促炎细胞因子的表达。此外，它在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中展现了稳健的体内疗效，显著减轻了体重下降并减少了炎症性巨噬细胞浸润。在此，我们报告了这些新型KDM6A/B抑制剂的详细设计、合成和药理学表征。

章节片段

KDM6A/B抑制剂的合成

如图1所示，化合物8-29以市售的4,6-二氯-2-(吡啶-2-基)嘧啶（6）为起始原料进行合成。各种胺对6进行亲核取代反应，以43-72%的收率得到关键的4-氨基嘧啶衍生物7a-q。随后，7a-q与各种杂环进行亲核取代反应，以29-80%的收率生成目标化合物8-27。随后用TFA对化合物27进行脱保护，然后与

结论

迄今为止，大多数KDM6A/B抑制剂由于分子极性高而存在细胞活性差的问题，限制了其治疗潜力。在此，我们在细胞水平上对GSK-J4进行了系统的构效关系（SAR）研究，重点关注苯氮杂环庚烷环、核心骨架、连接链和羧酸部分等关键结构元素。我们的结果表明，对苯氮杂环庚烷环进行螺环取代以及对连接链进行适度的空间位阻调节增强了

通用方法

本研究中使用的所有化学试剂和溶剂均为试剂级，未进一步纯化即可直接使用。柱色谱法采用300-400目或200-300目硅胶进行。薄层色谱分析使用硅胶60 F254板，在254 nm或365 nm紫外光下显色。 ¹H和¹³C NMR谱图分别使用Bruker AVANCE III 400光谱仪或Bruker Avance NEO 700光谱仪检测。化学位移（δ）以

统计与可重复性

使用GraphPad Prism V.8进行统计分析。数据以均值 ± 标准误表示。所用检验方法包括双因素方差分析（ANOVA）和非配对t检验。所有数据均至少代表三次独立实验。

CRediT作者贡献声明

宋子兰：写作 – 审阅与编辑、监督、构思。陈旺涛：写作 – 审阅与编辑、资金获取。王旭：写作 – 审阅与编辑、监督、资金获取。唐宇琪：写作 – 初稿、调查研究、数据整理。胡鑫：写作 – 初稿、调查研究、数据整理。沈安城：构思。王清华：软件

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（项目编号：82272815、82230090）、上海市地方高校高水平创新研究团队（项目编号：ZLCX20212301）、上海市科学技术委员会（项目编号：21DZ2292000-01）、上海交通大学转化医学奖项研究（20210103）。

唐宇琪|胡鑫|沈安城|王清华|宋子兰|陈旺涛|王旭