《Current Research in Insect Science》：CRISPR/Cas9-mediated knock-out of
abnormal chemosensory jump 6 (
acj6) gene impacts
Helicoverpa armigera antennal lobe structure
编辑推荐：
：通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术，研究人员在棉铃虫（Helicoverpa armigera）中敲除了异常化学感受跳跃6基因（acj6），结果导致触角叶（AL）体积显著增大，而整体脑结构未出现明显的形态学改变。突变体触角叶中肾小球（glomeru
：通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术，研究人员在棉铃虫（Helicoverpa armigera）中敲除了异常化学感受跳跃6基因（acj6），结果导致触角叶（AL）体积显著增大，而整体脑结构未出现明显的形态学改变。突变体触角叶中肾小球（glomeruli）的数量从野生型的75个增加至约100个。与野生型相比，Haacj6突变体的肾小球体积表现出更广泛的变异性，但平均肾小球体积保持不变。上述结果表明，Haacj6是触角叶精确结构及昆虫嗅觉神经回路形成的关键调控因子。
论文解读：
一、研究背景与科学问题
嗅觉在昆虫的生存中扮演着至关重要的角色，指导取食、交配、产卵以及躲避天敌和病原体等关键行为。昆虫通过触角等头部附肢上的嗅觉感器中的嗅觉受体神经元（ORNs）捕捉不同的气味分子，每个ORN表达一种或少数几种气味受体（ORs）介导气味检测。气味信号经由ORN轴突传递至初级嗅觉中枢——触角叶（AL），触角叶由众多肾小球（glomeruli）构成，是嗅觉信息处理的基本单元。肾小球的数目、大小、形状和空间组织在物种内高度保守，这种不变的肾小球图谱对于可靠的嗅觉处理至关重要，也为检测嗅觉回路发育或维持中的遗传扰动提供了敏感的解剖学读出指标。
在果蝇（Drosophila）中，POU结构域转录因子acj6已被证实是连接OR基因选择与轴突和树突靶向的重要调控因子，广泛表达于触角和下颚须ORN以及部分投射神经元（PNs）中，在整个发育过程中促进特定OR基因的表达并抑制其他OR基因。acj6的遗传破坏会导致OR错误表达以及ORN和PN投射的错误靶向。在鳞翅目家蚕（Bombyx mori）中也观察到类似功能。然而，在棉铃虫（Helicoverpa armigera）这一全球最具破坏性的农业害虫之一中，acj6是否参与嗅觉过程及其具体调控作用尚不清楚。为此，研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建了Haacj6敲除突变体，通过神经解剖学分析阐明acj6在棉铃虫嗅觉神经回路发育中的具体作用。
二、主要技术方法
研究人员从中国河南省新乡市棉田采集棉铃虫蛾，在人工饲料和可控气候条件下饲养。基于NCBI数据库获取Haacj6基因序列，利用CRISPR/Cas9设计工具设计两条靶向外显子1的sgRNA，经体外合成后与Cas9蛋白混合，通过显微注射导入新鲜产下的卵内。注射后孵育至羽化，对G0成虫进行基因组DNA提取和PCR扩增，经Sanger测序和序列比对筛选确认突变个体。随后采用免疫细胞化学方法，使用抗突触蛋白抗体SYNORF1标记脑内神经纤维网结构，通过共聚焦激光扫描显微镜获取图像，并利用Amira软件进行三维重建，测量脑内神经纤维网和肾小球的体积。
三、研究结果
3.1 雄性Haacj6突变体触角叶增大
免疫染色显示野生型和突变体的脑整体形态无明显差异，六个神经纤维网区域（触角叶AL、视叶OL、前视结节AOTU、蘑菇体MB、中央复合体CB和中脑）中，除AL外各区域体积在两种基因型间无显著差异。Haacj6突变体的AL体积（51.21 ± 4.06 ×10? μm3）显著大于野生型（33.08 ± 3.83 ×10? μm3）（P≤0.001），相对体积也显著增大（野生型2.88 ± 0.31%，突变体4.17 ± 0.36%，P=0.001）。这表明Haacj6在调节AL体积发育中发挥关键作用。
3.2 Haacj6突变体触角叶肾小球数量显著增加
尽管体积发生变化，突变体AL仍保持与野生型相似的肾小球层状结构。统计结果显示，基因型对肾小球数量有显著影响（F?,??=59.798，p<0.001），而性别无显著影响。雄性野生型每个AL含75.00 ± 1.67个肾小球，突变体为98.36 ± 7.96个；雌性野生型为73.86 ± 0.83个，突变体为99.11 ± 13.86个。Haacj6敲除后雌性肾小球数量的变化幅度大于雄性。这表明Haacj6突变通过增加肾小球数量来扩大AL体积，同时引入显著的个体间变异性。
3.3 Haacj6突变体触角叶肾小球体积表现出更广泛的变异
三维重建分析显示，Haacj6突变导致肾小球总体积增加，基因型是体积变化的主要驱动因素，性别无显著影响。在两种性别中，突变体均表现出更大的最大肾小球体积、更小的最小肾小球体积、更高的变异系数（CoV），而平均肾小球体积不变。雄性突变体肾小球总体积（3.41 ± 0.75 ×10? μm3）显著大于野生型（2.30 ± 0.10 ×10? μm3），雌性也呈现相同趋势。体积分布分析进一步证实，突变体中中等大小肾小球（20000–30000 μm3）的比例显著下降，而小型（<10000 μm3）和大型（>70000 μm3）肾小球的比例均有所增加。
3.4 Haacj6突变体触角叶肾小球同时表现出表型变异和稳定性
在突变体中，仅少数肾小球能够可靠地识别并匹配到野生型对应物。雄性中，巨肾小球复合体（MGC）的三个单元——CU、DMA和DMP持续可识别，其中CU的绝对体积在突变体中显著增大（野生型2.02 ± 0.18 ×10? μm3，突变体3.06 ± 1.15 ×10? μm3，p<0.001），而相对体积不变。DMP和DMA的绝对体积无显著差异，但相对体积均显著减小。雌性特异性肾小球在突变体中无法可靠区分，但G36、G37、G53、G70、G73和LPOG在两种性别的突变体中持续可识别，其中G37的绝对体积和G36的相对体积在基因型间存在显著差异。
四、讨论与结论
本研究发现Haacj6突变导致棉铃虫AL肾小球数量显著增加，这一表型与果蝇和家蚕中acj6缺失不改变肾小球数量的结果形成对比，提示Haacj6在调节AL区室化中具有此前未被认识的作用。肾小球数量的增加可能源于肾小球碎片化，即表达相同身份的ORN群体未能融合为单一的PN界定区室，从而产生多个较小的部分分离的"亚肾小球"。ORN轴突的错误靶向或PN树突野的扩展可能导致产生额外的解剖学上离散的神经支配位点，形成类似肾小球的结构。此外，突变体中肾小球边界较野生型模糊，胶质细胞支架的改变削弱肾小球边界也可能是肾小球数量增加的原因。
值得注意的是，尽管Haacj6突变引起肾小球组织的广泛结构变化，雄性特异性MGC、CO?特异性的LPOG以及一小群后部肾小球仍保持可识别性。这些接受GR和IR表达感觉神经元输入的肾小球可能较少依赖Haacj6进行正确的轴突靶向，或遵循部分不同的发育程序。
本研究证明Haacj6突变深刻重塑了触角叶的结构，改变肾小球结构、增加肾小球数量并改变肾小球体积分布，表明该基因对于嗅觉回路的正确组装至关重要。这些表型在昆虫物种间的相似性证明acj6的作用是深度保守的，不仅限于鳞翅目，也存在于双翅目及其他谱系中。这些发现突显了acj6及其直系同源基因作为嗅觉系统发育的关键调控因子，以及作为昆虫嗅觉图谱组织进化稳定性的核心贡献者的重要地位。
