全基因组CRISPR筛选发现PKMYT1抑制是IDH1突变胶质瘤中的合成致死弱点

《Cancer Letters》：Genome-wide CRISPR screen identifies PKMYT1 inhibition as a synthetic lethal vulnerability in IDH1-mutant glioma

　　PKMYT1是通过对IDH1突变细胞进行全基因组CRISPR筛选所鉴定出的一个选择性依赖因子。• IDH1突变细胞对PKMYT1的依赖性是由复制应激驱动的。• PKMYT1抑制在临床前模型中能有效抑制IDH1突变胶质瘤。**引言**异柠檬酸脱氢酶（IDH）1和2的突变界定了多种人类癌症中的不同分子亚群，包括胶质瘤（约80%）、软骨肉瘤（约20%）和急性髓系白血病（约20%）[1]。IDH1突变通常影响精氨酸132位（R132），主要见于胶质瘤、软骨肉瘤和肝内胆管癌，而IDH2突变（特别是在R140和R172位）在急性髓系白血病及其他髓系/淋巴系肿瘤中较为常见[2]。与癌症相关的IDH突变蛋白表现出新形成活性，能以NADPH依赖的方式将α-酮戊二酸（α-KG）转化为D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）[3]。D-2-HG作为α-KG依赖性双加氧酶的竞争性抑制剂，包括十-十一转位（TET）DNA去甲基化酶和组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDM）4、5等关键表观遗传酶，从而建立异常的表观遗传景观，通过损害分化过程驱动肿瘤发生。IDH突变所引起的独特转录组、表观遗传和代谢特征界定了这些恶性肿瘤的独特肿瘤生物学和疾病进程，同时也揭示了可被利用以实现更有效、选择性治疗的特定脆弱通路。新兴证据表明，D-2-HG相关的表观遗传景观通过改变维持基因组稳定性所需的局部染色质信号和高阶染色质组织来损害基因组维护功能[6, 7]。例如，D-2-HG抑制TET1/2并破坏同源重组（HR）DNA修复所需的染色质构象调节[6]。类似地，癌代谢物介导的KDM4B抑制导致DNA断裂位点邻近区域异常累积组蛋白3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3），损害依赖H3K9的Tip60和ATM招募[7]。此外，DNA和组蛋白甲基化水平升高标志着异染色质[8, 9]并促进染色质凝聚，限制DNA修复因子的装载并损害DNA复制进展[10, 11, 12]。一系列开创性工作表明，持续的复制叉扰动会导致RPA包被的单链DNA（ssDNA）积累和ATR依赖性G2/M细胞周期检查点的激活[13]。进一步地，近期研究强调了D-2-HG/KDM4A/H3K9me3轴在DNA复制应激中的重要作用。Schvartzman等人[14]证明D-2-HG诱导的异染色质形成加剧了复制应激，导致复制叉进展减慢。类似地，Couteau等人[15]发现D-2-HG和KDM4A抑制导致复制叉动态和端粒维持缺陷。G2/M检查点对于管理DNA复制应激至关重要，它通过防止过早进入有丝分裂并确保适当的DNA修复和复制叉稳定性来发挥作用[14, 15]。进入有丝分裂需要激活CDK1，CDK1与Cyclin B1结合形成活性复合物以驱动有丝分裂程序[16]。激酶WEE1和PKMYT1对CDK1的T14/Y15位进行抑制性磷酸化，在有复制不完全或DNA损伤存在时抑制进入有丝分裂[17, 18]。ATR和Chk1的激活通过维持CDK1的磷酸化状态使其进一步保持失活。靶向ATR、Chk1或WEE1会损害G2/M检查点控制，促使未修复DNA的细胞进入有丝分裂，导致有丝分裂灾难。因此，ATR、CHK1和WEE1抑制剂正在积极进行临床研究[12]。此外，单独靶向PKMYT1或与其他化疗药物联用，在肿瘤细胞中显示出令人鼓舞的治疗潜力[19, 20, 21, 22]。总体而言，靶向G2/M检查点可能改善具有高内源性或治疗诱导性DNA断裂的癌症的治疗结局。在本研究中，我们证明IDH突变癌症中异常的DNA代谢——以异染色质扩张、DNA修复缺陷和慢性复制应激为特征——为靶向G2/M检查点的疗法提供了强有力的依据。全基因组CRISPR筛选显示，G2/M检查点激酶PKMYT1对IDH1突变（IDH1^MUT^）癌症细胞的存活至关重要。在基因组复制不完全的环境中，PKMYT1的基因敲除或药理学抑制会导致非正常有丝分裂进入，引发有丝分裂灾难和细胞死亡。在机制上，我们表明D-2-HG通过抑制KDM4A促进H3K9me3相关的异染色质形成，从而阻碍DNA复制过程。增强的复制应激使细胞对PKMYT1介导的G2/M细胞周期检查点高度依赖。PKMYT1的阻断在携带IDH1^MUT^胶质瘤颅内异种移植物的临床前动物模型中抑制了肿瘤生长并改善了疾病结局。总体而言，我们的发现将PKMYT1鉴定为IDH1^MUT^肿瘤中的关键治疗脆弱性，并为在IDH1^MUT^胶质瘤中靶向PKMYT1作为精准治疗策略提供了强有力的依据。**章节摘要****全基因组CRISPR筛选鉴定了IDH1突变细胞中的抗性景观**为了界定IDH1野生型（IDH1^WT^）与IDH1^MUT^细胞存活所差异依赖的基因，我们使用TKOv3向导RNA（gRNA）文库进行了全基因组CRISPR敲除筛选（图1A和S1）。如预期，靶向必需基因的gRNA逐渐被耗竭，而靶向非必需基因的gRNA在存活群体中被保留（图S1E）。总体而言，我们鉴定出160个基因在IDH1^MUT^组中选择性耗竭，20个基因在IDH1^WT^细胞中耗竭。**讨论**IDH突变界定了胶质瘤、软骨肉瘤和急性髓系白血病中具有生物学和临床独特性的亚群，而由癌代谢物D-2-HG所创造的全部脆弱性谱仍有待阐明。在本研究中，我们证明IDH突变肿瘤表现出一种表观遗传导致的DNA复制应激状态，并且这与对有丝分裂进入调控激酶PKMYT1的依赖性相关。通过全基因组CRISPR筛选，我们鉴定出PKMYT1为……**结论**总之，我们的工作证明IDH1^MUT^癌症具有D-2-HG驱动的、基于染色质的复制缺陷，使其高度依赖PKMYT1介导的有丝分裂进入调控。通过将癌代谢物产生和异染色质扩张与复制应激及G2/M检查点依赖联系起来，我们为在IDH1^MUT^胶质瘤中靶向PKMYT1提供了机制性依据。我们的发现还提示了更广泛的原则，即癌症的代谢特征影响DNA代谢。**细胞培养与试剂**TS603细胞（RRID:CVCL_A5HW）由Timothy Chan博士[57]慷慨提供。GSC827和GSC923细胞来源于IDH1野生型患者样本[58]。BT142细胞（RRID:CVCL_D718）购自美国模式生物培养物收藏中心（ATCC）。IDH1^MUT^胆管癌细胞JJ012（RRID:CVCL_D605）由Joel Block博士慷慨分享。RPE1细胞由Andrew Holland[59]慷慨提供。U251细胞（RRID:CVCL_0021）购自Sigma。癌症干细胞（CSC）的培养……**作者贡献声明****Mirit I Aladjem：** 写作 – 审阅与编辑、调查、数据整理。**Hua Song：** 写作 – 审阅与编辑、方法论。**Wei Zhang：** 写作 – 审阅与编辑、方法论。**Fengchao Lang：** 写作 – 审阅与编辑、写作 – 原稿、方法论、调查、正式分析、数据整理、概念化。**Haiqing Fu：** 方法论、调查、数据整理。**Karambir Kaur：** 写作 – 审阅与编辑、方法论、调查、正式分析、数据整理。**Meili Zhang：****伦理声明**本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获美国国立卫生研究院（NIH）动物护理和使用委员会（ACUC）批准。（批准号：NOB-021）**利益冲突声明**作者声明不存在利益冲突。**资金支持**本研究由美国国立卫生研究院（NIH）内廷研究项目、国家癌症研究所（NCI）和国家癌症研究中心（CCR）支持。NIH作者的贡献是作为NIH联邦员工正式职责的一部分完成的，符合机构政策要求，被视为美国政府作品。然而，本文所呈现的发现和结论为作者本人观点，不一定反映NIH或美国卫生与公众服务部的观点。**利益冲突声明**? 作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。Fengchao Lang | Haiqing Fu | Karambir Kaur | Meili Zhang | Hua Song | Wei Zhang | Abiola A. Ayanlaja | Md Shahadat Hossain | Mirit I. Aladjem | Chunzhang Yang