基于网络毒理学、机器学习和分子对接技术，揭示三(1-氯-2-丙基)磷酸酯暴露对骨关节炎的毒理学效应及其作用机制

《Medical Care》：Revealing the toxicological effects and mechanisms of tris(1-chloro-2-propyl) phosphate exposure on osteoarthritis based on network toxicology, machine learning, and molecular docking

　　骨关节炎（OA）是一种影响全身所有关节的退行性疾病，全球有超过5亿人受到其影响，给医疗系统带来了巨大的负担。三(1-氯-2-丙基)磷酸酯（TCPP）是一种广泛使用的有机磷酸酯阻燃剂（OPFR），具有显著的环境和生物毒性。然而，TCPP暴露在OA中的作用及其分子机制尚未明确。本研究结合了网络毒理学、机器学习和分子对接技术，以识别与TCPP暴露和OA相关的关键靶点和途径。基于识别出的枢纽基因构建了一个诺模图模型，并使用基于相对RNA转录本子集的细胞类型识别（CIBERSORT）算法评估了免疫细胞的浸润情况。通过搜索多个公共数据库，我们找到了106个TCPP–OA共轭基因。基因本体论（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些靶点主要参与免疫调节和炎症反应，涉及丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路等途径。机器学习算法识别出4个枢纽基因：GRB2、GSK3B、IL18和THBS1。基于这些枢纽基因，我们构建了一个诺模图模型。校准曲线和决策曲线证明了该模型的良好诊断价值和临床效能。CIBERSORT算法识别出在OA进展过程中免疫细胞类型有显著变化的6种类型，这些枢纽基因与多种免疫细胞群体密切相关。分子对接分析表明TCPP与关键蛋白质之间存在相互作用。这些发现提供了首项证据，揭示了TCPP可能影响OA发病机制的途径，并确定了相关的毒理学靶点，为制定减轻其对OA影响的策略和更好地理解TCPP相关健康风险奠定了基础。然而，仍需要进一步的体内和体外研究来验证这些机制。

引言
阻燃剂是一类用作增塑剂的化学品，其核心功能是延缓火灾的起始和蔓延。有机磷酸酯阻燃剂（OPFRs）现已取代多溴联苯醚，在电子产品和建筑材料等众多全球消费领域得到广泛生产和使用。[1] 由于OPFRs不会与材料发生化学键合，它们可以通过挥发、磨损和渗漏释放到空气、水、灰尘和土壤中。[2] 流行病学证据显示，OPFRs可以通过吸入或皮肤吸收在人体尿液、脂肪组织和母乳中积累。[3] 长期暴露和积累的OPFRs已被证明会导致遗传毒性、生殖毒性和神经毒性等不良影响。[4,5] 三(1-氯-2-丙基)磷酸酯（TCPP）是一种重要的OPFR，在瑞典沿海地区、中国渤海地区和黄河流域被检测到相对较高的浓度（μg/L）。[6-8] 鉴于其环境持久性、生物累积潜能和已记录的毒性，TCPP并不被认为是多溴联苯醚的理想替代品。[9] 尽管已经证明TCPP会干扰涉及脂质、核酸和氨基酸的基本代谢过程，但其总体毒性的研究仍然缺乏系统性。现有研究主要集中在内分泌、神经和生殖毒性方面，关于其对骨骼健康潜在影响的研究报道较少。[10] 关键的是，初步研究表明TCPP可能引发炎症反应和氧化应激（OS），[11] 这两种都是骨关节炎（OA）的中心病理机制。因此，鉴于TCPP的广泛存在及其潜在的致病机制，研究其与OA的关联至关重要。

OA是一种与年龄相关的异质性疾病，病理上表现为滑膜关节内关节软骨的局部丧失，伴有不同程度的骨赘形成、软骨下骨变化和滑膜炎。[12] 作为最常见的关节疾病，它是疼痛、残疾和社会经济负担的主要来源，影响了全球约7.6%的人口。[13] 曾经简单地将OA视为一种退行性疾病，但数十年的研究表明，轻度炎症是其发病和进展的核心驱动因素。[14] 此外，过度的氧化应激和细胞死亡反应会加速OA的进展。[15] 值得注意的是，TCPP是一种潜在的环境毒素，可引起活性氧（ROS）积累和过度凋亡。[16] 尽管如此，直接将TCPP暴露与OA发病机制联系起来的分子机制仍大部分未得到探索。网络毒理学可以通过整合多个信号通路系统地揭示有毒物质的作用机制。[17] 因此，为填补这一研究空白，本研究采用了网络毒理学方法来探讨TCPP在OA中的潜在毒理学途径。通过构建复杂的网络调控模型并整合机器学习和分子对接等先进网络技术，我们旨在从多个角度识别TCPP的潜在致病机制并阐明其分子基础。这项研究为评估TCPP的环境健康风险提供了新的视角和证据，同时加深了我们对TCPP诱导的OA发展背后分子机制的理解。

材料与方法
2.1. TCPP靶点的收集
从PubChem数据库（美国国家生物技术信息中心[NCBI]，美国国家医学图书馆，美国国立卫生研究院，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索了TCPP的化学结构和简化分子输入行输入系统的表示法。[18] 在ChEMBL数据库（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）和Swiss Target Prediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/）中识别了TCPP的潜在靶点，物种指定为“Homo sapiens”。使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点名称进行了标准化，[21] 并在整合后建立了TCPP靶点库。
2.2. 识别与OA相关的靶点
使用关键词“Osteoarthritis”从GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）数据库中收集了与OA相关的潜在靶基因。[23]
2.3. 识别OA差异表达基因（DEGs）
为了识别差异表达基因（DEGs），我们从Gene Expression Omnibus（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中获取了3个微阵列数据集——GSE48556、GSE51588和GSE185059。[24] 这3个数据集被指定为训练集。GSE48556包括106个OA样本和33个对照样本，GSE51588包括40个OA样本和10个非OA对照样本，GSE185059包括3个OA样本和3个对照样本。因此，综合训练数据集包括149个OA样本和46个对照样本。使用R软件中的“limma”包进行了差异基因表达分析。绝对log2倍数变化（|log2FC|）> 1且调整后的P值< 0.05的基因被认为是显著差异表达的。使用R中的sva包校正了批次效应并整合了数据集。通过二维主成分分析聚类图可视化了批次效应去除前后的样本分布差异。随后，将DEGs与先前识别的TCPP靶点和OA靶点进行交集运算。重叠的靶点被视为由OPFRs在OA中诱导的交集基因。
2.4. 基因本体论（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析
使用Metascape（https://metascape.org）进行了基因本体论（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析。[25] GO分析涵盖了包括生物过程（BPs）、细胞组分（CCs）和分子功能（MF）在内的核心生物学功能维度，而KEGG富集分析阐明了与OA和TCPP相关的关键信号通路。随后，可视化了P值最小的前10个GO术语和前15个KEGG通路。
2.5. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建
我们将交集基因导入STRING数据库（STRING Consortium，https://string-db.org/）进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，将物种设置为“Homo Sapiens”，最小相互作用得分设置为0.4。使用Cytoscape 3.10.1软件（Cytoscape Consortium）可视化了PPI网络，并使用Centiscape 2.2工具筛选潜在靶点。
2.6. 使用机器学习筛选枢纽基因
采用了三种机器学习算法来识别与TCPP和OA相关的枢纽基因。这些算法包括最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF）。对于LASSO分析，我们使用“glmnet”包创建了一个回归模型，并进行了10折交叉验证，将“family”参数设置为“binomial”，并通过“lambda.min.”选择最佳lambda值。[27] 对于SVM-RFE模型，使用“e1071”包进行了10折交叉验证，以识别分类误差最低的变量。[28] 对于RF算法，模型使用了500棵决策树的集成大小来确保集成学习框架内的稳定性和预测性能。在这三种方法中都有交集的基因被识别为枢纽基因。
2.7. 枢纽基因的验证和诊断评估
为了进一步探讨枢纽基因对OA的诊断价值，使用“诺模图模型”构建了一个OA的预测诊断模型。通过校准曲线、决策曲线分析（DCA）和接收者操作特征（ROC）曲线从多个维度评估和验证了该模型的准确性和效率。此外，还使用外部数据集GSE178557进行了验证。
2.8. 枢纽基因的基因集富集分析（GSEA）
单基因集富集分析（GSEA）是一种常用的方法，用于探索与靶基因相关的功能通路。作为一种有效的功能分析工具，该方法根据靶基因表达水平将数据集分为高表达组和低表达组。通过比较这些组之间的通路富集差异，可以更全面地探索靶基因表达调控的生物学意义。因此，本研究使用“clusterProfiler” R包进行了单基因GSEA分析，以“c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt”基因集作为参考背景。
2.9. 免疫浸润分析
为了研究OA中的免疫细胞变化，使用了基于相对RNA转录本子集的细胞类型识别（CIBERSORT）算法来计算训练数据集中正常组和OA组的免疫浸润情况。[29] 随后，使用“样本相关性分析”来评估枢纽基因与免疫浸润之间的相关性，并据此生成热图。
2.10. 分子对接
分子对接技术被用来研究TCPP（配体）与靶基因（受体）之间的潜在相互作用机制。从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取了配体的3D化合物结构。使用Open Babel 3.1.1软件（Open Babel Project）将其转换为Mol2格式，然后通过AutoDock Tools 1.5.7软件（Molecular Graphics Laboratory，Scripps Research Institute）进行氢化处理，最终导出为pdbqt格式文件。从蛋白质数据库（PDB，https://www.rcsb.org）获取了靶蛋白结构。使用PyMOL 3.1.6.1（Schr?dinger, LLC）进行脱水和残基去除后，使用AutoDock Tools转换了结构。随后使用AutoDock Tools 1.5.7进行了配体-受体分子对接，并通过PyMOL进行了可视化。
2.11. 伦理声明
本研究仅使用了来自Gene Expression Omnibus数据库和其他公共数据库的公开可用且去标识的数据，未涉及直接招募人类参与者或收集可识别的个人信息。

结果
3.1. 识别TCPP暴露诱导的OA相关靶点
在本研究中，我们首先识别了与化合物相关的靶点和疾病基因。使用ChEMBL和Swiss Target Prediction数据库，我们获得了3658个与TCPP相关的靶点。同时，从GeneCards和OMIM数据库中检索到了6531个独特的OA靶基因。此外，为了识别OA患者中的DEGs，合并了3个数据集（GSE48556、GSE51588和GSE185059），共计得到46个对照样本和149个OA样本。主成分分析显示数据集内存在批次效应（图1A）。校正后，批次效应显著减少（图1B）。为了进一步验证对照组和OA样本之间的基因组差异，对合并的数据集进行了差异表达分析，识别出1673个DEGs。生成火山图来可视化OA中的这些DEGs的分布（图1C）。随后，通过将TCPP靶点、OA靶点和DEGs进行交集运算，识别出106个重叠基因（图1D）。详细信息见补充数字内容1中的表S1。

图1. 首次批次效应校正前3个数据集的主成分分析。（B）批次效应校正后的3个数据集的主成分分析。（C）火山图显示了训练集中的DEGs。（D）维恩图显示了TCPP靶点、OA相关基因和DEGs的交集。DEG = 差异表达基因，OA = 骨关节炎，TCPP = 三(1-氯-2-丙基)磷酸酯。
3.2. 交集基因的富集分析
使用Metascape数据库对106个交集基因进行了GO和KEGG分析。共识别出797个生物过程（BP）、58个细胞组分（CC）和73个分子功能（MF）。选择每个类别中的前10个术语进行可视化（图2A）。前5个最富集的BP术语是：细胞对细胞因子刺激的反应、炎症反应、细胞激活、细胞粘附的正向调节和白细胞激活。前5个最富集的CC项是：膜的一侧、质膜蛋白复合体、质膜的外部和内体膜。MF组分在激酶结合、蛋白激酶结合、细胞因子受体结合、DNA结合转录因子结合和转录因子结合方面显示出显著的富集。图2。图2。OA中TCPP相关毒理学目标的富集分析。(A) GO富集分析，包括生物过程、细胞组分和分子功能。(B) 气泡图显示了前20个KEGG通路。(C) TCPP暴露引起的MAPK信号通路中的基因表达变化。(D) TCPP暴露引起的PI3K-Akt信号通路中的基因表达变化。GO = 基因本体论，KEGG = 京都基因与基因组百科全书，OA = 骨关节炎，TCPP = 三(1-氯-2-丙基)磷酸酯。KEGG进一步阐明了与OA相关的关键信号通路，其中排名靠前的通路有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、癌症通路、结核病通路、脂质和动脉粥样硬化通路以及磷脂酰肌醇3-激酶–蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路（图2B）。此外，基于核心目标和通路的富集结果，我们重点关注了MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路（图2C，D）。详情见补充数字内容2中的表S2。3.3. 通过PPI分析和机器学习识别枢纽基因将交叉基因导入STRING数据库进行PPI分析。过滤掉孤立的目标后，得到了96个与TCPP-OA相关的目标。使用Cytoscape 3.10.1软件构建了一个包含96个节点和420条边的PPI网络。在网络中，节点代表目标蛋白质，边表示连接目标之间的相互作用。根据度数>8.75、介数中心性>142.354和接近中心性>0.004的标准，选出了18个相互作用最强烈的潜在目标（图3A）。详情见补充数字内容3中的表S3。随后，对这些18个潜在目标应用机器学习来识别枢纽基因。通过10倍交叉验证惩罚参数调整过程的LASSO回归分析得到了13个潜在的枢纽基因（图3B）。此外，SVM-RFE识别出18个关键的分子生物标志物（图3C），而RF识别出6个特征基因（重要性>4；图3D）。一个整合了这3个模型的韦恩图筛选出了4个与TCPP诱导的OA相关的枢纽基因：生长因子受体结合蛋白2（GRB2）、轴突蛋白-1/糖原合成酶激酶-3β（GSK3B）、白细胞介素-18（IL18）和血小板反应蛋白-1（THBS1；图3E）。图3。图3。通过PPI分析和机器学习在TCPP诱导的OA中识别枢纽基因。(A) PPI分析后，识别出18个潜在目标。(B) 通过10倍交叉验证确定最佳λ值的LASSO系数分析图。(C) SVM-RFE准确性曲线图。(D) 随机森林分析：树的数量与错误率的关系。(E) 通过机器学习识别的4个枢纽基因的韦恩图。LASSO = 最小绝对收缩和选择算子，OA = 骨关节炎，SVM-RFE = 支持向量机–递归特征消除，TCPP = 三(1-氯-2-丙基)磷酸酯。3.4. 构建枢纽基因诊断模型为了预测暴露于TCPP的患者的OA发病风险，我们构建了一个诺模图模型。诺模图量化了枢纽基因对总风险评分的贡献，为TCPP风险预测提供了一个直观的可视化工具（图4A）。校准曲线表明校准性能优异，模型预测的概率与实际事件率高度一致（图4B）。DCA分析在广泛的风险阈值范围内显示了显著的净收益，为模型的临床转化提供了重要支持（图4C）。此外，ROC曲线进一步证实了模型的强区分性能（曲线下面积[AUC] = 0.86；图4D）。每个基因的个体预测性能如下：GRB2（AUC = 0.723）、GSK3B（AUC = 0.748）、IL18（AUC = 0.700）、THBS1（AUC = 0.696；图4E）。此外，我们使用外部数据集GSE178557验证了枢纽基因的出色诊断性能，获得了0.75的AUC（图4F）。图4。图4。构建风险预测模型。(A) 枢纽基因的诺模图。(B) 预测模型的校准曲线。(C) 预测模型的决策曲线。(D) 模型的ROC曲线。(E) 使用外部数据集GSE178557验证枢纽基因的诊断性能。ROC = 受体操作特性。3.5. 单基因GSEA我们进一步使用单基因GSEA探讨了OA中关键基因的调控机制。结果揭示了4个关键基因的表达与多个生物通路密切相关（图5A–D）。例如：趋化因子信号通路、细胞外基质受体相互作用通路和前列腺素通路。图5。图5。单基因GSEA分析。(A) GRB2的GSEA分析。(B) GSK3B的GSEA分析。(C) IL18的GSEA分析。(D) THBS1的GSEA分析。GSEA = 基因集富集分析。3.6. 免疫浸润分析鉴于许多免疫炎症通路的显著富集，我们使用CIBERSORT算法分析了对照组和OA组之间22种免疫细胞亚群的免疫浸润差异。我们发现了6种表达差异显著的免疫细胞类型：CD8 T细胞、CD4记忆T细胞、静止T细胞、γδ T细胞、静止自然杀伤（NK）细胞、M0巨噬细胞和M1巨噬细胞（图6A，B）。此外，免疫细胞类型之间存在特定的相关性（图6C），例如静止肥大细胞与M0巨噬细胞之间存在正相关，以及幼稚B细胞与调节性T细胞之间存在正相关。相反，幼稚CD4 T细胞与单核细胞呈负相关。图6D展示了4个关键基因与免疫细胞浸润之间的关系。GRB2和GSK3B与调节性T细胞呈显著正相关，但与活化的CD4记忆T细胞呈显著负相关。IL18与中性粒细胞和活化的肥大细胞呈正相关，但与幼稚CD4 T细胞和CD8 T细胞呈负相关。THBS1与静止树突状细胞和静止NK细胞呈正相关，但与嗜酸性粒细胞和幼稚CD4+ T细胞呈负相关。图6。图6。免疫浸润分析。(A) 显示OA样本中22种免疫细胞类型浸润水平的堆叠条形图。(B) 比较OA组和对照组之间22种免疫细胞类型浸润水平的小提琴图。(C) OA中不同免疫细胞类型之间的相关性。(D) 显示4个关键基因与免疫细胞浸润水平相关性的热图。OA = 骨关节炎。3.7. 分子对接分析为了评估TCPP与枢纽基因之间的亲和力，我们进行了分子对接分析。通常，结合能<0 kcal>[30] 结果表明GRB2、GSK3B、IL18和THBS1都能自发地与TCPP结合（结合能分别为?3.58 kcal/mol、?4.15 kcal/mol、?3.91 kcal/mol和?2.7 kcal/mol；图7A–D）。我们确定了TCPP-GRB2的结合位点为PRO-212、ASN-188和ASN-214；TCPP-GSK3B的结合位点为PRO-357、LEU-359和THR-356；TCPP-IL18的结合位点为GLU-64；而TCPP-THBS1的结合位点为SER-38、VAL-31和GLY-33。这些发现为TCPP与所识别的枢纽蛋白之间的潜在相互作用提供了初步的计算证据。图7。图7。分子对接。(A) TCPP-GRB2复合物。(B) TCPP-GSK3B复合物。(C) TCPP-IL18复合物。(D) TCPP-THBS1复合物。TCPP = 三(1-氯-2-丙基)磷酸酯。4. 讨论OPFRs是分为3类的磷酸衍生物：氯化OPFRs、烷基OPFRs和芳基OPFRs。[31] TCPP属于氯化OPFRs，在消费品和商业产品中广泛使用。研究表明，TCPP暴露会在生物体内引发多种不良反应，包括氧化应激、免疫应激、神经毒性、细胞凋亡和细胞毒性增加。[32] 因此，美国环境保护署将TCPP归类为高危险材料。[9] 值得注意的是，TCPP引起的氧化应激和免疫应激是OA（一种慢性退行性关节疾病）的主要驱动因素。[33,34] OA的特点是软骨逐渐退化、滑膜炎症和软骨下骨重塑，[17] 其中持续的炎症微环境和氧化损伤是导致软骨细胞功能障碍和细胞外基质降解的关键机制。[35] 因此，TCPP暴露可能是OA发生和发展的重要环境风险因素。在这项研究中，我们识别出了106个与TCPP诱导的OA相关的毒理学目标。随后的富集分析揭示了参与OA进展的分子过程，突出了几个可能受TCPP暴露影响的通路。GO和KEGG通路分析表明，TCPP暴露可能主要通过BP（如炎症反应和免疫细胞激活）影响OA的发展，关键通路包括MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。MAPK信号通路作为调节细胞增殖、分化和应激反应的核心模块，主要由细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N端激酶和p38 MAPK等成员组成。[36] 该通路可以通过各种细胞外信号和应激因素激活，从而参与生理和病理过程，包括骨生成、炎症反应和细胞凋亡。[37] 在OA的发病机制中，MAPK信号通路中的JNK、ERK和p38的表达水平比正常软骨组织显著升高。最新证据表明，调节MAPK信号通路可能缓解OA的关节炎症和细胞外基质降解。[38,39] 此外，MAPK信号通路的异常激活可导致多种代谢物的水平改变。这些紊乱的代谢物进一步加剧了炎症和软骨降解。[40] 因此，MAPK信号通路现在被认为是一个调节OA发生和发展的主要信号通路。[41] PI3K-Akt信号通路在细胞内是一个关键的调节轴，通过作用于多个下游目标，广泛参与细胞周期进展、存活和炎症等关键过程。[42,43] 该通路在维持关节健康方面发挥着重要作用，其失调与OA的发病机制密切相关。[44] 研究表明，PI3K-Akt通路是调节软骨细胞存活和凋亡的关键调节器。在OA患者的软骨组织中，PI3K-Akt信号活性显著降低[45]；相反，上调Akt表达可以有效抑制软骨细胞凋亡并促进细胞存活。[46] 此外，PI3K-Akt通路还与OA进展的病理变化密切相关，包括软骨下骨硬化、滑膜炎症和软骨整体稳态的破坏。[47] 接下来，我们构建了一个PPI网络并识别出18个潜在目标。对于这些目标，我们使用3种机器学习算法识别出4个枢纽基因：GRB2、GSK3B、IL18和THBS1。GRB2作为复杂信号网络中的核心分子，在调节细胞生长、分化和存活等基本BP中发挥着关键作用。[48] 之前的研究表明，GRB2通过调节雷帕霉素（mTOR）通路的机械靶点参与了OA的病理过程，并且也是OA患者免疫浸润过程中的一个关键泛素相关基因。[49] 进一步的研究证实，GRB2在激活关键信号通路（如PI3K/AKT和ERK/MAPK）中起着核心调节作用。[50,51] Mo等人的研究关注了GRB2相关结合蛋白2（GAB2）在OA中的作用和机制。他们发现GAB2敲低可激活软骨细胞自噬，减少炎症反应，并通过抑制MAPK和核因子κB（NF-κB）信号通路显著缓解OA的病理损伤。[52] GSK3B是细胞分化和凋亡途径的关键调节因子，调节成骨细胞和破骨细胞之间的平衡。[53] 研究表明，GSK3B通过下调β-连环蛋白来维持软骨细胞表型，从而有助于保持软骨细胞外基质的完整性。GSK3B抑制后软骨中β-连环蛋白的短期上调也可能在体内诱导类似OA的特征。[54] 此外，GSK3B的失活可以通过线粒体机制在关节软骨中引起慢性损伤，导致ROS产生和细胞衰老。[55] 有趣的是，环境污染物TCPP在暴露后会诱导细胞氧化应激。[56] 氧化应激通过下游信号分子（例如ROS介导的PI3K-Akt通路）间接调节GSK3B的活性，进一步增强了其对OA相关通路的调节效应。IL-18是IL-1家族中的促炎细胞因子，由软骨细胞、成骨细胞和关节内的纤维母细胞样滑膜细胞分泌。[57,58] 研究表明，在OA患者的滑液、滑膜、软骨和血清中IL-18显著过表达，其水平与疾病进展呈正相关。[59,60] 在OA的病理过程中，IL-18通过上调关键炎症介质（如诱导型一氧化氮合成酶、环氧化酶-2和IL-6）驱动软骨细胞的炎症反应。[57] 更重要的是，它显著增加了基质金属蛋白酶（MMP）的表达，同时抑制蛋白聚糖和II型胶原蛋白的合成，直接导致关节软骨的降解和丢失。[61,62] 这些证据表明IL-18在OA进展中的关键作用。异常机械应力是引发OA的关键因素。作为重要的细胞外基质蛋白，THBS1不仅参与细胞-基质相互作用，还作为机械信号转导的关键介质。[63] 在OA中，THBS1可以通过减少血管生成和炎症来减缓疾病进展。[64] 有趣的是，THBS1在OA软骨的不同区域表达有所不同。表达通常在受损更严重的区域较低，这可能与整个骨关节炎（OA）过程中的血管侵犯有关。[65] 研究表明，软骨细胞释放的THBS1可能对T细胞具有抗炎作用。此外，来自脂肪源性干细胞的THBS1在胶原蛋白酶诱导的OA小鼠模型中也显示出保护作用，通过抑制炎症免疫反应。[66] 这些发现表明THBS1可能是一种潜在的对抗OA的保护因素。为了验证枢纽基因的诊断性能，我们构建了一个DCA模型。校准曲线和ROC曲线都表明，这4个枢纽基因对OA具有很好的诊断价值。DCA曲线表明这些枢纽基因在OA的临床应用中具有优越性。这进一步证实了枢纽基因在OA中的关键作用。单基因GSEA分析显示，这4个枢纽基因通过多种生物途径影响OA的进展。值得注意的是，几个与炎症相关的信号通路被富集，表明炎症调节在OA中起着关键作用。随着对OA病理机制研究的深入，免疫系统在OA进展中的核心作用变得越来越明显，骨-免疫失衡已成为一个关键因素。这种失衡会破坏骨重建，加剧炎症，并加速关节退化。[67] 在这项研究中，我们使用了CIBERSORT算法来探索OA中22种免疫细胞的浸润水平。结果表明，6种免疫细胞类型之间存在显著的表达差异。此外，这些枢纽基因与多种免疫细胞群相关，包括巨噬细胞、T细胞亚群和NK细胞，这与之前的研究结果一致，这些免疫细胞参与了OA的发生。[68-70] 这些发现表明，免疫微环境的变化可能是TCPP暴露与OA进展之间的一种可能联系。此外，分子对接为TCPP与枢纽蛋白之间潜在的相互作用提供了计算支持。结果表明，所有枢纽蛋白都能自发地与TCPP结合，其中TCPP-GSK3B的结合亲和力最低（?4.15 kcal/mol）。总之，我们的网络毒理学方法为TCPP诱导的OA提供了有价值的见解，但仍存在一些局限性。本研究仅通过网络毒理学和分子对接等计算方法进行了预测分析，缺乏体外细胞实验和体内动物模型的验证。未来的工作应通过细胞实验验证TCPP对铰链蛋白功能和通路活性的调节作用，使用动物模型研究其体内毒理学表型，并补充代谢动力学和剂量-反应关系分析，以提高我们发现的科学严谨性和可靠性。此外，还需要大规模的长期流行病学研究来追踪TCPP暴露与OA发病率之间的动态关联，从而加强其毒理学效应的证据链。

**5. 结论**

本研究通过网络毒理学、机器学习和分子对接探索了TCPP诱导的OA的潜在靶点和分子机制。结果表明，TCPP可能通过炎症反应和免疫调节影响OA的发病和进展，主要涉及MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。机器学习算法识别出4个可能因TCPP而加剧OA的枢纽基因：GRB2、GSK3B、IL18和THBS1。此外，分子对接验证了TCPP与这些枢纽基因之间的结合亲和力。这些发现表明TCPP暴露可能驱动OA的进展，并为开发针对环境诱发病的治疗策略奠定了基础。然而，直接实验验证所识别的靶点和机制仍然是必要的，以确认计算预测的结果。

**作者贡献**

- 构思：杨斌
- 数据整理：杨斌
- 形式分析：王向进
- 研究：杨斌、王向进、卓莉、陈玉桐、何倩松
- 方法论：杨斌、王向进、卓莉、陈玉桐
- 项目管理：何倩松
- 资源：何倩松
- 软件：杨斌
- 监督：何倩松
- 验证：杨斌、何倩松
- 可视化：杨斌
- 原始草稿写作：杨斌
- 审稿和编辑：杨斌、王向进、卓莉、陈玉桐、何倩松

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