谷氨酸棒杆菌中分泌型与胞内谷氨酸脱羧酶共表达用于无质粒γ-氨基丁酸生物合成

《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：Co-expression of secretory and intracellular glutamate decarboxylase for plasmid-free γ-aminobutyric acid biosynthesis in Corynebacterium glutamicum

　　

摘要

γ-氨基丁酸（GABA）是一种具有重要生理功能的天冬酰胺类氨基酸。利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）生产GABA具有巨大的潜力，然而细胞生长所需的最适中性pH与谷氨酸脱羧酶（GAD）活性所需的酸性pH之间的不相容性严重限制了合成效率。为应对这一挑战，本研究开展了一种多维协同代谢工程策略。首先，筛选出四种在近中性pH下具有活性的GAD，其中LcGAD被确定为最有效的候选酶。随后，为确保L-谷氨酸前体的充足供应并将碳通量从竞争副产物合成途径中转移，过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和外源谷氨酸脱氢酶基因gdhA，同时阻断了乙酸和乳酸的合成，使GABA产量从19.6 g/L显著提高至28.9 g/L。接下来，表达了分泌型LcGAD以促进产物外排；同时，敲除了编码乌头酸酶阻遏蛋白（acnR）和碳代谢主调控因子（ramB）的基因，进一步增强了向L-谷氨酸生物合成的碳通量。此外，动态下调了参与肌酸酯合成的麦芽寡糖海藻糖合酶基因treY和RNA聚合酶σ因子基因sigD，以提高细胞包膜通透性。最终获得的最优无质粒菌株GAD-15可在胞内和胞外同时合成GABA，在摇瓶发酵中产生41.1 g/L GABA，在2.4 L生物反应器中产生110.1 g/L GABA。本研究开发的胞内外协同合成策略为利用谷氨酸棒杆菌高效生产GABA及其他代谢产物提供了新思路。