组蛋白中和保护缺血性脑组织免受卒中相关性肺炎不良后果

《Acta Neuropathologica》：Histone neutralization protects the ischemic brain against the consequences of stroke-associated pneumonia

　　

细菌性肺炎通过尚待阐明的机制加重缺血性卒中。在缺血性卒中患者中，研究人员显示卒中相关性肺炎与不良临床结局及长期中性粒细胞失调相关。在暴露于短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）的小鼠中，于卒中后第3天诱导实验性肺炎链球菌（S. pneumoniae）肺炎，会损害神经功能恢复，并增加血脑屏障（BBB）破坏、脑中性粒细胞浸润、脑微血管血栓形成及进行性脑萎缩。抗生素阿莫西林（amoxicillin）仅部分改善肺炎相关的神经功能缺损与中性粒细胞浸润。蛋白质组学分析揭示，肺炎在MCAO小鼠外周血中性粒细胞中诱导出脱颗粒、血小板活化及NETosis特征，该特征被阿莫西林部分逆转。后续研究表明，中性粒细胞是肺炎相关血脑屏障破坏与微血管血栓形成的关键介质。值得注意的是，在肺炎期间给予中和细胞外组蛋白蛋白的抗体，可减轻缺血损伤、恢复神经功能恢复并预防卒中相关性肺炎小鼠的长期脑萎缩。当在肺炎发生时给予脱氧核糖核酸酶-I（DNase-I）降解中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）、LDC7559阻断NET形成或AZD4831抑制髓过氧化物酶（MPO），均未观察到上述保护作用。本研究明确细胞外组蛋白是炎症性脑损伤的关键驱动因子，并确立组蛋白中和作为一种可抵御卒中后肺炎有害效应的策略。

论文解读：《Acta Neuropathologica》刊载的组蛋白中和与卒中相关性肺炎脑保护研究

研究背景与立项依据

缺血性卒中仍是全球长期致残与死亡的主要原因。卒中后由于术后免疫抑制，约30%患者在住院期间发生感染，肺炎发生率约8.5%–14.3%，ICU中可达28%。肺炎通过脓毒症等途径成为卒中相关死亡的重要原因，但肺炎是否直接加重缺血性脑损伤、其机制如何仍不清楚。既往预防性抗生素、β受体阻滞剂、干扰素-γ等策略未能改善卒中相关性肺炎或卒中结局。中性粒细胞在缺血性卒中早期即浸润脑实质，并可释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs，neutrophil extracellular traps，由DNA与髓过氧化物酶MPO、组蛋白等组成的网状结构）参与免疫调控与组织损伤。然而中性粒细胞及其分泌内容物在卒中相关性肺炎神经结局中的作用未知。为回答该问题，研究人员依托德国NOFF-S队列与小鼠MCAO模型，探究卒中后肺炎如何影响神经恢复与脑损伤，并寻找可干预靶点。

主要关键技术方法

研究人员采用两项核心证据来源：一是前瞻性纳入德国Essen大学医院卒中单元的首发急性缺血性卒中患者队列NOFF-S（2022年10月起、分析至2025年8月21日），于入院24–<72 h、72–144 h及3个月进行临床评分与流式细胞术；二是雄性C57BL/6J小鼠经颅内动脉线栓法建立30 min或60 min短暂性MCAO，卒中后3天气管内接种肺炎链球菌诱导肺炎。干预包括阿莫西林、抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞、DNase-I、LDC7559、AZD4831及抗组蛋白抗体；终点含改良Clark神经评分、转棒/走绳/旷场/新物体识别行为学、流式细胞术、脑切片甲酚紫与免疫组化、LC–MS/MS中性粒细胞蛋白质组学、ELISA检测细胞外组蛋白-H4与瓜氨酸化组蛋白-H3（Cit-H3）相关DNA。

研究结果

卒中相关性肺炎与不良临床结局及长期中性粒细胞失调

NOFF-S队列中肺炎患者90天mRS更差，单因素与校正年龄性别后多因素分析均提示肺炎预测不良结局。流式显示肺炎患者早期活化CD15^highCD62L^int中性粒细胞比例低，4–6天及3个月时CD15^low亚群比例持续异常，提示长期中性粒细胞失调。

肺炎加剧缺血小鼠神经缺损、微血管通透性与血栓炎症

MCAO后3天肺炎使直肠温度与体重下降，1–2天神经评分恶化；虽未扩大梗死体积，但脑水肿、IgG外渗（BBB破坏）、ICAM-1上调、CD45⁺白细胞与Ly6G⁺中性粒细胞浸润、GP-Ibα⁺微血管血栓增多、Iba1⁺小胶质/巨噬细胞密度降低且活化增强，并出现胞外组蛋白-H4沉积；60 min MCAO模型得到一致结果。

阿莫西林不完全逆转肺炎相关神经缺损与微血管炎症

阿莫西林降低肺泡灌洗液菌量并部分缓解BBB破坏与微血管血栓，恢复小胶质/巨噬细胞密度，却不改善神经评分、ICAM-1、脑内白细胞/中性粒细胞浸润及胞外组蛋白沉积，模拟了临床试验中抗生素未能改善卒中结局的现象。

阿莫西林不逆转缺血脑内肺炎相关中性粒细胞反应

流式显示肺炎使脑内中性粒细胞、单核细胞、T/B/NK细胞浸润增加；阿莫西林逆转外周血中性粒细胞活化，却不影响脑内任一白细胞亚群浸润，免疫组化证实实质与血管旁中性粒细胞均不被抗生素减少。

肺炎在外周血中性粒细胞诱导脱颗粒、血小板活化与NETosis特征

LC–MS/MS显示肺炎中性粒细胞中35个差异蛋白，富集脱颗粒（CCT8、COTL1、MYP等）与血小板活化（CAP1、ALDOA、ACTN4等）；阿莫西林逆转其中多数脱颗粒/血小板活化蛋白，但TOLLIP等炎症蛋白未被逆转。

抗体耗竭中性粒细胞、阻断NET形成、抑制MPO与中和组蛋白逆转早期病理

抗Ly6G清除中性粒细胞可减轻BBB破坏与血栓；DNase-I、LDC7559、AZD4831也影响早期病变；而抗组蛋白-H4/H2A抗体在2天与56天终点均减轻损伤、恢复行为并防萎缩。

中性粒细胞是肺炎相关BBB破坏与微血管血栓的关键介质

耗竭实验确证中性粒细胞为肺炎放大脑损伤的必要细胞；但仅中和组蛋白可获长期保护，单纯降解或阻断NET、抑制MPO不足以为卒中后肺炎提供神经保护。

讨论与结论翻译

讨论指出，抗生素清除肺部细菌却未消除胞外组蛋白等中性粒细胞衍生损伤分子，因此不能完全阻止脑损伤。NETs的DNA骨架被DNase-I降解、gasdermin-D被LDC7559抑制或MPO被AZD4831抑制，均不足以复现组蛋白中和的脑保护，说明游离细胞外组蛋白而非完整NET结构或MPO酶活是关键致病介质。该研究将卒中相关性肺炎的远隔器官损伤机制定位于循环中性粒细胞释放的组蛋白，为感染后神经恶化提供了机制解释。

研究结论部分译文：

细菌性肺炎通过尚待阐明的机制加重缺血性卒中。在缺血性卒中患者中，研究人员显示卒中相关性肺炎与不良临床结局及长期中性粒细胞失调相关。在暴露于短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）的小鼠中，实验性肺炎链球菌（S. pneumoniae）肺炎于卒中后3天诱导，损害了神经功能恢复，并增加血脑屏障破坏、脑中性粒细胞浸润、脑微血管血栓形成及进行性脑萎缩。抗生素阿莫西林仅部分改善肺炎相关神经功能缺损与中性粒细胞浸润。蛋白质组学分析揭示肺炎在MCAO小鼠外周血中性粒细胞中诱导脱颗粒、血小板活化及NETosis特征，并被阿莫西林部分逆转。后续研究证明中性粒细胞是肺炎相关血脑屏障破坏与微血管血栓形成的关键介质。值得注意的是，肺炎期间给予中和细胞外组蛋白蛋白的抗体，减轻了缺血损伤、恢复神经功能恢复并预防卒中相关性肺炎小鼠的长期脑萎缩。在肺炎发生时给予DNase-I降解NETs、LDC7559阻断NET形成或AZD4831抑制MPO，均未观察到此类保护作用。本研究明确细胞外组蛋白为炎症性脑损伤的关键驱动因子，并确立组蛋白中和作为一种抵御卒中后肺炎有害效应的策略。