孟鲁司特通过调控p38MAPK信号通路保护鱼藤酮诱导的人神经母细胞瘤细胞神经毒性

《Discover Neuroscience》：Montelukast protects against rotenone-induced neurotoxicity in human neuroblastoma cells through regulation of the p38MAPK signaling pathway

　　

半胱氨酰白三烯受体1（CysLTR1）已被证实与多种炎症性疾病相关，但其在帕金森病（PD）发病机制中的作用仍有待探索。本研究阐明了孟鲁司特预处理在体外鱼藤酮暴露的SH-SY5Y细胞中的神经保护潜力。值得注意的是，孟鲁司特有效减弱了鱼藤酮诱导的CysLTR1上调，抑制了p38-MAPKAPK2信号轴，并减少了促炎性细胞因子。研究还发现，孟鲁司特缓解了氧化应激级联反应，恢复了抗氧化酶水平，包括激活NRF2-KEAP1轴。此外，孟鲁司特处理恢复了动力相关蛋白1（DRP1）水平，保留了酪氨酸羟化酶（TH）和PARK7/DJ1的表达，并减少了SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的积累。孟鲁司特通过减轻氧化应激、调节炎症反应以及保护关键的PD生物标志物，展现出对抗鱼藤酮诱导的细胞损伤的神经保护作用。这些结果表明孟鲁司特有作为PD治疗药物重新利用的潜力。 临床试验编号：不适用。

研究背景与目的

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种全球范围内影响数百万人的神经退行性疾病，其核心病理特征包括黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）多巴胺能神经元的进行性死亡，导致脑内多巴胺水平下降，从而引发运动迟缓、肌肉强直和震颤等运动障碍。PD的标志性病理改变还包括不可溶的α-突触核蛋白（α-synuclein）异常沉积，这会破坏正常的细胞功能并加剧神经变性。此外，α-突触核蛋白的积累会扰乱线粒体功能、细胞氧化还原平衡，并触发胶质细胞活化和神经炎症，进一步加速神经元损伤和疾病进展。

鱼藤酮（rotenone，Rot）是一种天然来源于豆科植物根部的化合物，常被用于有机农业杀虫。由于其神经毒性特性，Rot被广泛用作实验模型来诱导氧化应激、线粒体功能障碍和特定脑区多巴胺能神经元的丢失，从而高度模拟PD中观察到的关键神经退行性过程。Rot诱导的PD会导致p38MAPK-MAPKAPK2信号通路上调，这是神经元炎症和凋亡的关键调节因子。该信号通过激活核因子κB（NF-κB）调节黑质纹状体区域的细胞因子蛋白和mRNA表达，从而导致神经元损伤。

半胱氨酰白三烯受体1（CysLTR1）已被证明参与多种中枢神经系统疾病，主要通过其在小胶质细胞活化中的作用。孟鲁司特（montelukast，MK）是一种成熟的CysLT1受体拮抗剂，通常用于哮喘治疗，并在阿尔茨海默病（AD）、脑缺血、多发性硬化症（MS）和癫痫等多种神经系统疾病中显示出神经保护特性。然而，MK在Rot诱导的细胞炎症、线粒体分裂和多巴胺能生物标志物调节中的体外效应尚不清楚。因此，本研究旨在评估MK在Rot诱导的SH-SY5Y细胞中，通过p38-MAPKAPK2/NRF2-KEAP1信号通路对抗氧化防御、线粒体调节和多巴胺能神经元生物标志物的保护性调节机制，为MK在PD中的再利用提供新的见解。

主要技术方法

研究人员使用了人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，该细胞系来自印度国家脑研究中心（NBRC）。主要关键技术方法包括：采用MTT比色法评估细胞活力；使用荧光探针DCFDA评估细胞内活性氧（ROS）水平；通过生化方法检测丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（Catalase）水平；采用商品化ELISA试剂盒定量检测促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的水平；通过免疫印迹分析（Western blot）检测NRF2、KEAP1、DRP1、CysLTR1、p-p38、p-MAPKAPK2、TH、α-突触核蛋白和PARK7/DJ1的蛋白表达水平；采用免疫细胞化学（ICC）结合共聚焦显微镜观察酪氨酸羟化酶（TH）的细胞表达情况。

研究结果

评估细胞活力的MTT试验：Rot在10至0.1 μM浓度范围内呈浓度依赖性降低细胞活力，其中0.3 μM Rot被选为诱导亚致死性氧化和蛋白毒性应激的浓度。MK在10至0.01 μM剂量范围内不影响细胞活力，因此选择1 μM和10 μM作为预处理浓度。

孟鲁司特减轻氧化应激标志物：与未处理细胞相比，Rot暴露显著增强了MDA积累和ROS生成。1 μM和10 μM的MK预处理均显著逆转了这些变化，将MDA和ROS水平恢复至基线附近。

孟鲁司特恢复细胞中抗氧化酶水平：Rot处理导致GSH含量和过氧化氢酶活性显著降低。MK预处理在不同剂量下显著恢复了GSH和过氧化氢酶水平。

孟鲁司特的抗炎活性：与对照组相比，Rot处理显著增加了TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。1 μM和10 μM的MK预处理均显著降低了TNF-α水平，对IL-1β和IL-6也有抑制作用。

Rot对NRF2-KEAP1表达的影响及MK的调节作用：免疫印迹分析显示，Rot暴露显著破坏了NRF2-KEAP1信号，导致NRF2蛋白丰度急剧下降，KEAP1水平显著升高。1 μM和10 μM的MK预处理有效缓解了这些变化，恢复了NRF2表达并抑制了KEAP1水平。

孟鲁司特减弱Rot诱导的DRP1表达：Rot暴露导致线粒体分裂的关键介质——动力相关蛋白1（DRP1）蛋白水平显著升高。MK预处理以浓度依赖性方式减弱了这一效应，在1 μM和10 μM剂量下均显著抑制了DRP1表达。

孟鲁司特抑制p38-MAPKAPK2信号的激活：Rot暴露显著提高了磷酸化p38（p-p38）和磷酸化MAPKAPK2（p-MAPKAPK2）的表达水平。1 μM的MK显著降低了p-p38水平，10 μM的MK表现出更强的抑制效果。同时，10 μM的MK显著降低了p-MAPKAPK2水平。

孟鲁司特对多巴胺能生物标志物的保护作用：免疫荧光染色和免疫印迹分析表明，Rot处理导致TH表达显著降低，而MK预处理以剂量依赖性方式恢复了TH表达。Rot处理诱导了α-突触核蛋白水平的显著升高，MK处理以剂量相关的方式显著减轻了α-突触核蛋白的积累。此外，Rot处理导致神经保护标志物PARK7显著下调，而1 μM和10 μM的MK预处理均显著恢复了PARK7蛋白水平。

孟鲁司特抑制Rot激活的细胞CysLTR1表达：与对照组相比，Rot暴露显著升高了SH-SY5Y细胞中CysLTR1的表达。1 μM和10 μM的MK处理均显著降低了CysLTR1表达。

讨论与结论

本研究表明，MK通过多种机制有效减轻Rot诱导的神经毒性，包括减少氧化应激、调节神经炎症和保护PD相关生物标志物。具体而言，MK通过上调NRF2及相关酶来增强抗氧化防御，通过抑制p38-MAPKAPK2信号通路和下调促炎性细胞因子来抑制神经炎症。此外，MK还能降低CysLTR1受体表达，保护线粒体完整性，防止α-突触核蛋白聚集，并增加TH表达。

研究结论指出，研究人员的发现揭示了CysLTR1-p38-MAPKAPK2/NRF2-KEAP1是MK在PD病理学中靶向的一个新轴。总体研究结果表明，MK是一个有前景的PD治疗候选药物。