《The Egyptian Journal of Bronchology》：Diagnostic performance of pathogen-targeted next-generation sequencing for pulmonary infections: a retrospective observational study
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背景：本研究针对传统病原学检测（conventional etiological tests，CETs）在肺部感染诊断中的局限性，评估病原靶向二代测序（pathogen-targeted next-generation sequencing，ptNGS）的临床
背景：本研究针对传统病原学检测（conventional etiological tests，CETs）在肺部感染诊断中的局限性，评估病原靶向二代测序（pathogen-targeted next-generation sequencing，ptNGS）的临床应用价值。
方法：研究人员开展了一项回顾性观察研究，纳入了2022年11月至2023年8月期间在中国北方一家三级医院常规临床诊疗中接受支气管肺泡灌洗液病原靶向二代测序（bronchoalveolar lavage fluid pathogen-targeted next-generation sequencing，BALF-ptNGS）的108例疑似肺部感染患者的临床记录。研究人员将ptNGS结果与传统病原学检测（CETs）结果进行了比较评估。人口统计学、实验室、影像学、微生物学及治疗相关数据均从现有病历中回顾性提取。研究人员对诊断性能、病原体一致性及抗菌药物管理进行了比较分析，临床显著病原体的定义依据美国胸科学会/美国感染病学会（American Thoracic Society/Infectious Diseases Society of America，ATS/IDSA）诊断标准。
结果：ptNGS在病原体总体检出灵敏度方面显著优于CETs（68.7% vs. 44.8%；p = 0.003），细菌检出灵敏度（66.1% vs. 23.8%；p = 0.001）及病毒检出灵敏度（81.8% vs. 51.7%；p = 0.04）亦显著更优，且具有更优的阴性预测值（p < 0.05）。一致性分析显示，18种病原体物种存在显著一致性（kappa = 0.50–0.86），以细菌为主（一致率为50%）。在肺炎病例（n = 86）中，ptNGS在95.3%的病例中检出病原体，可区分单一微生物感染（70.9%）和多种微生物混合感染（29.1%）。至关重要的是，ptNGS在74.1%的病例中为抗生素调整提供了依据：治疗升级（44.4%）、停药（23.2%；避免了不必要的抗菌药物暴露）及经验性方案调整（10.2%）。肺炎患者与对照组相比，病原体序列载量显著升高（细菌：p < 0.05；病毒：p < 0.01）。
结论：在这项回顾性队列研究中，ptNGS在细菌和病毒病原体检测方面显示出高于传统病原学检测的灵敏度，并提供了快速信息，且这些信息常与抗菌药物治疗调整相关。然而，ptNGS结果需结合临床背景谨慎解读，尚需进一步的前瞻性多中心研究来验证其对以患者为中心的结局的影响。
论文解读
一、研究背景与问题
下呼吸道感染是全球范围内的重要健康问题，显著影响死亡率统计，2017年报告显示其导致平均预期寿命缩短约1.29年。尽管抗菌治疗不断进步，但由于传统病原学检测（CETs）灵敏度有限且周转时间较长，近半数住院患者仍无法获得明确的病原学诊断。这一诊断不确定性进一步因多微生物混合感染的日益增多、难培养或不可培养病原体的存在以及新发病毒威胁而加剧——在这些情况下，经验性广谱治疗常导致抗菌药物过度使用、多重耐药菌产生及院内传播风险增加。
宏基因组二代测序（mNGS）作为一种不依赖培养的病原体无偏检测方法虽已崭露头角，但其常规临床应用受到多重技术及实际障碍的制约：宿主核酸背景干扰严重、试剂和计算成本高昂、生物信息学解读复杂，以及环境污染导致的高假阳性率。这些局限催生了对一种更具针对性、临床可操作性更强的替代方案的需求——该方案需在保留NGS广覆盖优势的同时，提升特异性并优化工作流程效率。
病原靶向二代测序（ptNGS）通过基于超多重PCR扩增富集一组精选的临床相关病原体来解决上述挑战。通过选择性扩增约100–200种常见呼吸道微生物（包括细菌、病毒、真菌、非典型病原体及关键抗菌药物耐药基因）的基因组区域，ptNGS显著减少了宿主干扰，缩短了周转时间（<24小时），降低了成本，并简化了数据分析。然而，直接比较ptNGS与全面传统病原学检测在支气管肺泡灌洗液（BALF）中表现的研究仍然有限，尤其是在多微生物混合感染检测及其与真实世界治疗决策的关联方面。
二、研究设计与方法
研究人员在中国北方一家三级医院开展了一项回顾性观察研究，纳入2022年11月至2023年8月期间因疑似肺部感染在常规临床诊疗中接受纤维支气管镜检查、BALF采集及ptNGS检测的108例成年患者。纳入标准包括：年龄≥18岁、住院期间临床疑似肺部感染、BALF标本行ptNGS检测、临床及实验室记录完整。排除标准包括：临床信息不足以进行诊断判定、BALF标本不合格或不符合要求、ptNGS检测因技术失败而未成功。
研究采用的关键技术方法包括：ptNGS检测采用Respiratory 100病原体靶向测序试剂盒（Union Medicine，中国深圳），靶向108种临床常见病原体及6种抗菌药物耐药基因，在Illumina MiniSeq平台完成测序；CETs采用多种技术，包括血琼脂、麦康凯琼脂及含万古霉素的嗜血杆菌选择性巧克力琼脂进行细菌培养，沙保弱葡萄糖琼脂进行真菌培养，MALDI-TOF质谱（Bruker，德国）进行病原体鉴定，VITEK 2系统（bioMérieux，法国）进行药敏试验，7500实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国）检测病毒、耶氏肺孢子菌及非典型病原体，Platelia?曲霉半乳甘露聚糖抗原EIA检测（Dynamiker，中国），GeneXpert MTB/RIF系统（Cepheid，美国）结合抗酸染色鉴定结核分枝杆菌。诊断判定采用由三位认证肺科医师独立审查、不一致时集体讨论达成共识的临床医师判定复合参考标准。
三、研究结果
临床数据：108例患者中，86例（79.6%）经临床医师判定为肺炎，22例（20.4%）为非肺炎对照组。两组在年龄和性别上无显著差异，但中性粒细胞百分比（中位数：70.7% vs. 65.0%，p = 0.030）和降钙素原水平（0.20 vs. 0.04 ng/mL，p = 0.001）存在显著差异，提示这两项指标可能作为肺炎的潜在实验室标志物。
病原体分布与检出率比较：ptNGS在85例（78.7%）中检出病原体，涵盖30个不同物种，而CETs仅在29例（26.9%）中获得阳性结果，涵盖12个物种。细菌检出率差异显著（ptNGS：78.8% vs. CETs：26.8%，p < 0.01），病毒检出率同样差异显著（70.3% vs. 25.9%，p < 0.05）。主要细菌病原体为铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌；主要病毒病原体包括EB病毒、SARS-CoV-2、甲型流感（H1N1）病毒和1型单纯疱疹病毒。
诊断性能评估：以135种肺炎致病病原体组成的复合参考标准进行头对头比较。ptNGS在总体病原体检测中灵敏度较CETs高23.9%（68.7% vs. 44.8%，p = 0.003），特异度（99.5% vs. 99.9%，p = 0.005）和阴性预测值（99.6% vs. 98.9%，p < 0.001）亦存在显著差异。细菌鉴定灵敏度提高42.3%（66.1% vs. 23.8%，p = 0.001），病毒诊断灵敏度提高30.1%（81.8% vs. 51.7%，p = 0.04）。ptNGS额外识别出32种肺炎相关病原体，但漏检15种病原体（包括各3株铜绿假单胞菌和烟曲霉、2株结核分枝杆菌复合群等），并产生25个假阳性结果。CETs漏检52种病原体，其中半数集中于6种常见肺炎相关病原体。肺炎患者中细菌和病毒的标准化病原体序列载量显著高于非肺炎对照组（细菌：p < 0.05；病毒：p < 0.01）。
ptNGS与CETs一致性评估：在108份BALF样本中对48种潜在病原体进行一致性评估，18种病原体物种存在显著一致性（κ = 0.50–0.86，p < 0.05），其中3种完全一致、10种高度一致、5种中度一致。细菌病原体一致性最高（9种，占50%），其次为病毒和真菌（各占16.6%），非典型病原体和分枝杆菌分别占11.1%和5.5%。
肺部感染组不同感染类型分布：86例确诊肺炎患者中，ptNGS在82例（95.3%）中检出至少一种病原体。单一微生物感染占70.9%（61/86），以细菌（36.0%）、病毒（23.0%）和分枝杆菌（21.3%）亚型为主。多微生物混合感染占29.1%（25/86），其中细菌-病毒混合（28.0%）和病毒-真菌混合（20.0%）最常见，12.0%显示细菌-病毒-真菌三重混合感染。
抗菌药物治疗调整：ptNGS平均周转时间（23.9小时）显著短于细菌培养（55.1小时）和真菌培养（168.9小时）。74.1%（80/108）的病例在ptNGS报告后调整了抗生素方案，其中45.4%在报告当日实施调整，15.7%在次日调整。治疗升级占44.4%（48/108），停药占23.2%（25/108），经验性方案确认占10.2%（11/108），15.7%无需抗生素治疗。停药病例中56%为非肺炎诊断患者（如特发性肺纤维化、结节病和恶性肿瘤），64%在ptNGS报告后立即停药。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，ptNGS的优越诊断性能源于其技术设计：超多重PCR富集约108种临床相关呼吸道病原体，减少了宿主核酸干扰并放大低丰度微生物靶标，从而提高了检测灵敏度，尤其对难培养或不可培养微生物效果显著。ptNGS不仅改善了铜绿假单胞菌和肺炎链球菌等常见病原体的检测，还识别了涉及SARS-CoV-2和甲型流感（H1N1）等病毒的混合感染，反映了研究期间的流行病学背景。研究还发现，ptNGS在结核分枝杆菌、丝状真菌和非典型病原体检测方面虽灵敏度低于CETs，但成功识别了传统方法难以诊断的临床显著感染，包括多例结核病、侵袭性真菌肺炎、支原体肺炎和鹦鹉热衣原体肺炎。ptNGS在揭示多微生物混合感染方面尤为有价值，其中细菌-病毒混合感染最常见，其次为病毒-真菌混合感染，并在12%的患者中检测到涉及细菌、病毒和真菌的复杂三重感染。
研究局限性包括：ptNGS对结核分枝杆菌和真菌的灵敏度降低（可能与其坚固细胞壁导致的核酸提取效率低下有关）；25个ptNGS检出被判定为假阳性（可能反映气道定植、背景呼吸道微生物群、环境或试剂污染，或潜伏/再激活病毒核酸的检测）；单中心设计和有限样本量限制推广性。
结论：在这项回顾性观察研究中，ptNGS在细菌和病毒病原体检测方面显示出高于传统病原学检测的灵敏度，周转时间短于传统培养。ptNGS还能识别多微生物混合感染模式，其报告常与后续抗菌药物治疗调整相关。然而，ptNGS结果需结合临床谨慎解读，因为检出可能反映定植、潜伏病毒感染或污染，且临床医师判定参考标准并非完全独立于待评估检测方法。尚需采用独立参考标准和以患者为中心的结局指标的前瞻性多中心研究来明确ptNGS在肺部感染中的临床影响。
