基于生长阶段依赖的微藻有机物分离与提取方法优化研究

《Journal of Applied Phycology》：Optimisation of phase-dependent microalgal organic matter isolation and extraction methodology

中文摘要翻译： 藻华是一个全球性问题，会导致过量藻类有机物（algal organic matter, AOM）的形成，从而造成水源水质恶化并干扰水处理工艺。从藻细胞中提取藻类有机物的方法耗时较长，且有时无法有效实现细胞裂解。本研究旨在优化微藻胞外有机物（extracellular organic matter, EOM）和胞内有机物（intracellular organic matter, IOM）的提取与表征方法，并应用流式细胞术（flow cytometry）评估微藻种群数量与活性。研究人员利用配备叶绿素检测荧光滤光片的图像型细胞计数器，基于叶绿素完整性对小球藻（Chlorella vulgaris）种群及其活性进行定量分析。与传统基于显微镜的评估方法相比，该技术显著节省了时间。在优化后的藻类有机物提取方法中，研究人员通过将细胞经历五次冷冻（-196 °C）/解冻（70 °C）循环释放胞内有机物组分，流式细胞术分析证实该方法可实现细胞的完全裂解。这种优化的微藻提取方法为分离胞内有机物提供了一种快速高效的手段。随后，研究人员采用多种技术对来自小球藻的藻类有机物进行了表征，并在三个不同生长阶段进行评估：早期静止期（early stationary phase, ESP）、晚期静止期（late stationary phase, LSP）和衰退期（declining phase, DP）。培养物的溶解性有机碳（dissolved organic carbon, DOC）浓度表明，微藻产生的可溶性胞外有机物显著增加，且随培养时间延长而升高。由于各组分中比紫外吸光度（specific ultraviolet absorbance, SUVA254）值均低于1.6 L mg-1 C m-1，研究人员推测胞外和胞内组分中有机物的芳香性较低。研究发现SUVA254值随培养时间延长在胞外和胞内组分中均呈下降趋势，表明芳香性有机物所占比例降低。荧光激发-发射矩阵光谱（fluorescence excitation-emission matrix spectroscopy, FEEMs）显示，胞外有机物组分中含有类腐殖酸、类溶解性微生物产物（soluble microbial product, SMP）和类富里酸物质，而胞内有机物组分中主要含有类蛋白物质，表明该提取方法能有效分离细胞内藻类有机物。本研究首次清楚地证明，小球藻胞外有机物组分的荧光峰强度随生长阶段推进而增强，表明荧光强度对生长阶段具有显著依赖性。本研究提出的优化提取方法和高效细胞计数技术，应有助于推进环境中微藻华的管理，以及实验室和工业环境中微藻培养的管理。

论文解读：

一、研究背景与问题

微藻在水体中大量繁殖会显著恶化水质，其产生的藻类有机物（algal organic matter, AOM）不仅可能直接危害人类和动物健康，还会产生导致异味和异嗅的化合物，使水体不适合饮用或娱乐用途，并增加水处理成本。藻类有机物包含胞外有机物（extracellular organic matter, EOM）和胞内有机物（intracellular organic matter, IOM）两部分。EOM是藻类在指数期和静止期通过代谢过程释放的，而IOM则是在衰亡期或物理化学处理过程中通过细胞裂解释放的。准确分离和表征EOM与IOM对于理解微藻的环境影响和水处理工艺优化至关重要。然而，现有的藻类有机物提取方法耗时且有时无法有效实现细胞裂解。物理方法如超声破碎、匀浆和冻融循环常用于裂解微藻细胞，但很少有研究评估提取后的细胞裂解程度或剩余完整细胞数量。特别是针对小球藻（Chlorella vulgaris）的冻融提取方法报道有限且效果不一，Rao等人（2023）甚至声称常规冻融法无法裂解小球藻细胞壁。此外，以往研究往往未能确认EOM和IOM的提取是否完全，也未准确量化完整细胞与裂解细胞的比例，这些对于评估所取样藻类有机物的纯度和完整性至关重要。因此，本研究旨在优化IOM提取方法，利用流式细胞术（flow cytometry）快速准确计数细胞并验证细胞裂解效率，并系统比较不同生长阶段下小球藻EOM和IOM的特征差异。

二、研究内容与主要结论

研究人员选用小球藻（Chlorella vulgaris，CS-42菌株，购自澳大利亚国家藻类培养物保藏中心CSIRO）作为模式微藻，在改良Bold基础培养基（Modified Bold's Basal Medium, MBBM）中光自养培养100天。研究优化了流式细胞术计数方法，以叶绿素a自发荧光为指标快速定量完整细胞数量。通过比较不同稀释倍数、流速和采集时间，最终确定以10 μL min^-1流速采集60秒为最佳条件，相比传统显微镜人工计数可节省大量时间。在提取方法优化方面，研究人员将锆珠辅助与液氮（-196 °C）/70 °C水浴冻融循环相结合，评估了1次、3次和5次冻融循环的裂解效率。流式细胞术分析表明，5次冻融循环可实现超过99.6%的细胞裂解，因此被确定为标准提取方案。利用该优化方法，研究人员在早期静止期（ESP，约第20天）、晚期静止期（LSP，约第55天）和衰退期（DP，约第100天）三个生长阶段分别提取了EOM和IOM组分，并通过多种分析技术对其进行了系统表征。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：流式细胞术（flow cytometry），利用488 nm激发激光和670 nm长通检测器采集叶绿素a自发荧光，用于快速定量小球藻细胞数量和评估细胞裂解效率；锆珠辅助冻融循环提取法，将细胞悬液与100、200和800 μm锆珠混合后涡旋振荡，再经历五次液氮冷冻（-196 °C，20-30秒）和70 °C水浴解冻（10分钟）循环，以实现IOM的完全释放；紫外-可见分光光度法（UV-Vis spectrophotometry），用于测定680 nm光密度（OD₆₈₀）和254 nm紫外吸光度（UV₂₅₄）；总有机碳分析仪（Shimadzu TOC-L），用于测定溶解性有机碳（DOC）和总氮（TN）浓度；离子色谱（ion chromatography, IC）系统，用于测定EOM和IOM组分中六种无机阴离子浓度；荧光激发-发射矩阵光谱（FEEMs），激发波长190-400 nm（5 nm间隔）、发射波长300-550 nm（1 nm间隔），用于表征有机物荧光组分特征。

四、研究结果

1. 1.
   快速流式细胞术细胞计数技术：研究人员通过优化稀释倍数、流速（10、30、60 μL min^-1）和采集时间（15、30、45、60、90秒），最终确定以10 μL min^-1流速采集60秒可获得最准确的细胞计数结果。与传统显微镜人工计数需数小时相比，流式细胞术仅需60秒即可获得自动化计数结果，具有高通量分析优势。
2. 2.
   小球藻生长阶段确定：小球藻在MBBM中培养100天，细胞数量从初始的2.2 × 10⁶ cells mL^-1增加至ESP时期的8.2 × 10⁶ cells mL^-1，随后在DP时期下降至4.2 × 10⁶ cells mL^-1。生长阶段可划分为：适应期（0-10天）、指数生长期（11-25天）、静止期（26-55天）和衰退期（>56天）。OD₆₈₀与流式细胞术计数的细胞数量呈现一致的生长模式。DOC浓度从初始的3.3 mg L^-1逐渐增加至第98天的21.4 mg L^-1，表明藻类释放的可溶性有机物随培养时间显著积累。
3. 3.
   不同生长阶段EOM和IOM的分离：通过离心和过滤获得EOM组分，细胞沉淀经锆珠辅助五次冻融循环裂解后离心过滤获得IOM组分。流式细胞术验证表明，三个生长阶段的IOM悬浮液中剩余完整细胞均低于0.4%，证实五次冻融循环可实现完全细胞裂解。
4. 4.
   EOM和IOM的表征：DOC、TN、UV₂₅₄和SUVA₂₅₄分析显示，三个生长阶段中IOM的DOC浓度均高于EOM，DP时期IOM的DOC浓度最高达30.8 mg L^-1。EOM和IOM的DOC值均随培养时间增加，从ESP到DP分别增加2.9倍和1.8倍。EOM中TN从ESP的38.3 mg L^-1降至DP的25 mg L^-1，表明硝酸盐被藻类消耗；IOM中TN从5 mg L^-1逐渐增加至7 mg L^-1以上，表明氮被纳入藻细胞。所有SUVA₂₅₄值均低于1.6 L mg^-1 C m^-1，表明有机物芳香性较低，且EOM和IOM的SUVA₂₅₄值均随培养时间下降。EOM的SUVA₂₅₄值在各生长阶段均高于IOM，表明EOM中芳香性有机物比例相对更高。
5. 5.
   无机阴离子分析：EOM组分中硝酸盐浓度从ESP的169 mg L^-1降至DP的80 mg L^-1，表明微藻对硝酸盐的同化作用；IOM组分中硝酸盐浓度为1.7-4.6 mg L^-1。
6. 6.
   荧光激发-发射矩阵光谱表征：EOM组分在三个生长阶段均显示类腐殖酸（区域V）、类富里酸（区域III）和类溶解性微生物产物（区域IV）荧光峰，且随培养时间延长荧光峰强度显著增加，这是首次清楚证明小球藻EOM荧光峰强度随生长阶段增强。IOM组分主要显示类芳香蛋白（区域II）荧光峰，λ_ex/λ_em为230/330-350 nm，另有280/325 nm的低峰代表类微生物产物贡献；IOM荧光峰强度从ESP到LSP仅略有增加，DP时期未进一步增加，表明随培养时间延长，微藻形成的荧光有机物被排出细胞外。

五、讨论与结论

讨论部分指出，流式细胞术通过检测叶绿素a在685 nm的荧光发射可实现快速准确的小球藻计数，与传统显微镜方法相比具有显著的速度优势。DOC随培养时间增加可能源于主动分泌和被动释放两种机制：活跃生长和静止期以主动分泌可溶性代谢物和胞外聚合物为主，衰退期则因营养限制和细胞衰老导致膜完整性受损，通过细胞损伤或裂解释放胞内组分。锆珠辅助冻融循环中，液氮快速冷冻促进细胞内和细胞外冰晶形成，70 °C解冻诱导热膨胀、渗透失衡和反复相界应力，涡旋过程中锆珠提供额外碰撞、磨损和局部剪切力，共同促进细胞破碎。虽然实现了>99.6%的细胞裂解效率，但该值代表细胞破碎效率而非胞内化合物的定量回收率，反复冻融处理可能改变热或氧化不稳定的生物分子，离心和过滤可能选择性去除颗粒态、聚集态或与细胞碎片结合的化合物，因此回收的IOM代表操作定义的溶解态组分。EOM和IOM的SUVA₂₅₄值均低于1.6 L mg^-1 C m^-1，表明有机物芳香性较低，主要为非腐殖质、亲水性和低分子量有机物。EOM中类腐殖酸、类富里酸和类微生物产物荧光峰强度随培养时间显著增加，而IOM中类蛋白荧光峰强度仅略有增加，表明随培养时间延长，微藻形成的荧光有机物被排出细胞外。本研究首次将流式细胞术用于追踪小球藻生长阶段并计数IOM提取后残留细胞，优化的提取方法和高效细胞计数技术将有助于推进环境中微藻华的管理以及实验室和工业环境中微藻培养的管理。