CTRP9-CreERT2-tdTomato敲入小鼠品系的构建及其对肌肉和脂肪组织微血管内皮细胞的特异性靶向与表征

《Cell Regeneration》：The generation and characterization of CTRP9-CreERT2 knock-in mice for targeting endothelial cell muscle and adipose tissues

　　

血管内皮细胞（vascular endothelial cells, ECs）在不同组织中表现出显著多样性。为阐明各内皮细胞亚型的独特生理作用，利用Cre-loxP重组系统的遗传小鼠品系至关重要。然而，仍缺乏特异性靶向肌肉内皮细胞的Cre小鼠品系。在此，通过对公开单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集的分析，C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-9（C1q/tumor necrosis factor-related protein-9, CTRP9）被鉴定为肌肉和脂肪组织中微血管内皮细胞的高度选择性标志物。随后，研究人员利用CRISPR/Cas9生成了CTRP9-Cre^ERT2-tdTomato敲入小鼠品系，其中tdTomato作为内源性CTRP9表达的报告基因。通过将这些小鼠与Rosa26^LSL?EYFP报告小鼠杂交并给予他莫昔芬，研究人员在出生后至成年阶段的心脏、骨骼肌、舌和脂肪组织的CD31⁺ ECs中观察到特异性EYFP和tdTomato表达。EYFP⁺细胞主要被鉴定为微血管内皮细胞，而非动脉或静脉内皮细胞。CTRP9-Cre^ERT2小鼠模型允许对这一独特内皮细胞群体进行精确而有效的遗传操作，为研究其在肌肉代谢、再生和病理生理学中的作用提供了有价值的工具。

血管内皮细胞（vascular endothelial cells, ECs）衬贴于血管和淋巴管内表面，是循环与组织之间的屏障，并参与维持血管稳态、调节血流、血管张力、炎症反应、血栓形成和血管新生。内皮功能障碍是动脉粥样硬化、糖尿病和心力衰竭等全身性疾病的重要特征。ECs在不同血管床和组织间存在显著表型和功能异质性，在骨骼肌和心肌等特殊组织中尤为明显。肌肉血管内皮细胞与肌纤维及卫星细胞（satellite cells, SCs）形成功能性“肌血管单元”，参与代谢稳态、再生能力和运动适应。因此，理解肌肉血管内皮细胞的分子生物学十分重要。Cre重组酶小鼠模型，尤其是诱导型遗传工具，可实现血管内皮基因表达的精确时空控制。但传统Tie2或VE-Cadherin（Cdh5）启动子驱动的Cre小鼠广泛靶向多器官内皮细胞，缺乏组织特异性；组织特异性内皮Cre品系仍很稀缺。为此，研究人员利用公开单细胞转录组数据寻找组织特异性ECs标志物，并聚焦CTRP9。CTRP9是脂联素旁系同源物，作为脂肪因子发挥作用；经蛋白酶切割后释放球状结构域gCTRP9，通过与脂联素受体1（adiponectin receptor 1, AdipoR1）和N-cadherin相互作用，触发多条信号通路，调节糖脂代谢、血管舒张和细胞分化。CTRP9在人类广泛表达，在脂肪、心脏、前列腺、皮肤和睾丸中水平较高；小鼠中曾认为CTRP9表达主要限于脂肪组织，但其精确细胞来源及作为组织特异性ECs标志物的潜力尚不清楚。基于此，研究人员利用公开scRNA-seq数据集鉴定CTRP9为肌肉组织血管内皮细胞潜在标志物，并生成CTRP9-Cre^ERT2-tdTomato敲入小鼠，使tdTomato反映内源性CTRP9分布；研究证明Cre活性特异局限于心脏、骨骼肌、舌等肌肉器官以及脂肪组织的ECs，为精确遗传操作该组织特异性EC亚群提供了工具。

关键技术方法概括：研究人员分析公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，包括EC Atlas（11种成年小鼠组织）、Tabula Muris（20种器官、38种细胞类型）及脂肪组织数据；采用CRISPR/Cas9介导同源重组在CTRP9位点敲入Cre^ERT2-P2A-tdTomato-WPRE-polyA；通过PCR、Southern blot和16个潜在脱靶位点Sanger测序验证；将CTRP9-Cre^ERT2小鼠与Rosa26^LSL?EYFP报告小鼠杂交并给予他莫昔芬诱导；采用多重免疫荧光、RNA原位杂交和BaCl₂诱导胫骨前肌（tibialis anterior, TA）损伤模型评估标记特异性。

研究结果：
1. CTRP9 is a potential marker for microvascular endothelial cells in muscle and adipose tissues。研究人员通过分析EC Atlas、Tabula Muris和脂肪组织scRNA-seq数据集发现，CTRP9在心脏和肢体骨骼肌ECs中丰度高，在非肌肉器官中表达低；在心脏中主要见于微血管ECs，包括毛细血管、毛细血管小动脉和毛细血管小静脉，而动脉、大静脉和淋巴内皮细胞中表达降低；在骨骼肌中广泛表达于多种毛细血管内皮亚型，但大动脉ECs中较低；在心脏和肢体骨骼肌中，CTRP9仅存在于ECs，心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞或免疫细胞中极少或无表达；脂肪组织血管ECs中亦显著富集。因此，CTRP9可能是肌肉和脂肪组织微血管ECs的潜在标志物。
2. Generation of the CTRP9-Cre^ERT2 knock-in mouse line。研究人员利用CRISPR/Cas9将Cre^ERT2-P2A-tdTomato-WPRE-polyA插入CTRP9外显子2的ATG后；P2A为自剪切肽，使Cre^ERT2和tdTomato独立表达，tdTomato指示内源性CTRP9。PCR在CTRP9-Cre^ERT2 KI/+小鼠中分别得到预期2,207 bp和1,991 bp条带，WT无；Southern blot显示EcoNI消化为14.87 kb、BstEII消化为7.58 kb片段；16个潜在脱靶位点未检测到突变或基因组改变，证明准确敲入。
3. CTRP9 expression in the vascular endothelial cells in muscle tissues。借助tdTomato报告，E14.5胚胎中上颈段脊髓和心脏少数细胞可见tdTomato，并与CD31共定位；P12和P60时，心脏、肢体骨骼肌和舌中可见tdTomato⁺细胞，多数或全部共表达CD31。这表明CTRP9主要存在于出生后和成年阶段心脏及骨骼肌组织的血管内皮细胞中。
4. CTRP9-Cre^ERT2 specifically marks the microvascular endothelial cells within the cardiac tissue。研究人员将CTRP9-Cre^ERT2小鼠与Rosa26^LSL?EYFP报告小鼠杂交并给予他莫昔芬；未给他莫昔芬时无EYFP信号，说明无泄漏。P12和P60心脏中，所有EYFP⁺细胞均表达CD31，EYFP⁺CD31⁺细胞分别占CD31⁺ ECs的63.60%±2.84%和60.56%±1.14%；多数EYFP⁺细胞共表达tdTomato；RNA原位杂交显示所有CTRP9⁺细胞均有EYFP表达。以α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）和Eph受体B4（Eph receptor B4, EphB4）区分动脉和静脉内皮细胞后，EYFP⁺CD31⁺α-SMA⁺细胞分别占CD31⁺α-SMA⁺动脉ECs的19.98%±3.72%和14.12%±0.65%，EYFP⁺CD31⁺EphB4⁺细胞分别占CD31⁺EphB4⁺静脉ECs的33.68%±2.48%和31.64%±2.56%，提示其偏好标记微血管ECs。
5. CTRP9-Cre^ERT2 specifically marks the microvascular endothelial cells in skeletal muscle and tongue。骨骼肌中EYFP⁺CD31⁺细胞占CD31⁺ ECs的P12 79.21%±2.89%、P60 62.92%±2.38%；舌中分别为63.08%±2.31%和77.90%±2.05%；多数EYFP⁺细胞共表达tdTomato，RNA原位杂交在舌中确认CTRP9 mRNA与EYFP共定位。骨骼肌中EYFP⁺α-SMA⁺细胞占动脉ECs的26.80%±3.60%和38.82%±2.33%，舌中为26.04%±4.02%和32.95%±2.27%；骨骼肌中EYFP⁺EphB4⁺细胞占静脉ECs的43.76%±0.59%和38.38%±2.64%，舌中为33.92%±1.36%和35.16%±1.06%。胃和小肠中EYFP在CD31⁺ ECs中极少，明显低于心脏和肌肉组织。说明EYFP标记骨骼肌和舌微血管ECs。
6. CTRP9-Cre^ERT2 marks the microvascular endothelial cells in adipose。在P12和P60背部皮下脂肪中，EYFP⁺CD31⁺细胞占CD31⁺ ECs的76.96%±2.58%和80.90%±1.20%；EYFP⁺CD31⁺α-SMA⁺细胞占动脉ECs的37.46%±0.95%和39.35%±2.35%；EYFP⁺CD31⁺EphB4⁺细胞占静脉ECs的44.24%±0.63%和39.93%±2.22%。P60睾丸和脑中未检测到EYFP标记细胞或tdTomato信号。说明CTRP9-Cre^ERT2有效标记脂肪微血管ECs，且重组高度限于肌肉和脂肪组织。
7. Endothelial-specific labeling of CTRP9-Cre^ERT2 during muscle regeneration。研究人员建立BaCl₂诱导肌肉损伤模型，他莫昔芬连续给药5天，随后向TA肌注射BaCl₂，损伤后5天取材。损伤肌肉中EYFP⁺细胞数量增加，所有EYFP⁺细胞均表达CD31；所有增殖内皮细胞（CD31⁺Ki67⁺）均为EYFP⁺，表明再生过程中新形成ECs来源于CTRP9⁺微血管ECs；EYFP⁺细胞不表达巨噬细胞标志物F4/80。说明损伤条件下CTRP9-Cre^ERT2介导的标记仍严格保持内皮特异性。

讨论总结：研究人员开发了CTRP9-Cre^ERT2-tdTomato敲入小鼠，其中CTRP9-Cre^ERT2特异性标记肌肉组织（心脏、骨骼肌和舌）及脂肪组织的微血管ECs。该研究揭示了小鼠CTRP9的精确表达谱。既往研究曾认为小鼠CTRP9表达限于脂肪组织，但其基于bulk组织qPCR，无法区分细胞类型。研究人员对不同单细胞转录组数据集的分析显示，CTRP9主要表达于多种组织的ECs，包括脂肪和骨骼肌组织，而在实质细胞如脂肪细胞、肌细胞及其他基质细胞中表达极少。CTRP9-Cre^ERT2报告小鼠中tdTomato和EYFP信号也仅见于肌肉和脂肪组织的ECs。因此，尽管CTRP9最初被认定为脂肪因子，其主要由肌肉和脂肪组织微血管ECs产生。CTRP9已知主要影响骨骼肌细胞、心肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞，提示其分布与广泛的内分泌和旁分泌功能一致。该品系为特异性靶向肌肉组织和脂肪组织血管内皮细胞提供了新资源，可更精确研究内皮多样性和血管功能。研究结论翻译：CTRP9-Cre^ERT2小鼠模型允许对这一独特内皮细胞群体进行精确而有效的遗传操作，为研究其在肌肉代谢、再生和病理生理学中的作用提供了有价值的工具。