基于蛋白酶可切割纳米抗体-荧光蛋白融合体的可擦除免疫染色技术

《Analyst》：Nanobody-fluorescent protein fusions for erasable immunostainingOpen Access

　　

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）染色被广泛用于可视化细胞和组织中的生物分子。传统IF通常依赖于荧光团偶联抗体，其制备需要化学修饰步骤，这可能损害抗体性能并在后续纯化过程中造成产物损失。此外，迭代免疫染色依赖于严苛的剥离或荧光淬灭处理，这可能破坏样品结构和表位完整性。在此，研究人员提出基于蛋白酶可切割纳米抗体-荧光蛋白融合体（Nanobody-Fluorescent Protein Fusions, NFPFs）的可逆IF染色方法。与荧光团标记抗体不同，NFPFs是基因编码的，无需合成后化学修饰即可生产。通过在纳米抗体和荧光蛋白之间引入烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶切割位点，研究人员工程化构建了靶向HER2和EGFR的NFPFs，其保留了高靶标特异性，并实现了对Capan-1细胞的稳健、浓度依赖性免疫染色。TEV介导的切割有效去除荧光报告分子，同时保持细胞形态和抗原可及性，允许后续靶标染色。不同受体的顺序标记证明了在同一标本内进行迭代免疫染色的可行性。总之，NFPFs为分子成像提供了一种简单、可扩展且通用的方法，可实现多轮免疫染色。

论文解读：基于蛋白酶可切割纳米抗体-荧光蛋白融合体的可擦除免疫染色平台

一、研究背景与问题提出

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）染色是细胞生物学和病理学研究中可视化生物分子分布与表达的核心技术。传统IF染色依赖荧光团偶联抗体，其制备过程涉及复杂的化学共价偶联步骤，这一过程不仅可能损害抗体的抗原结合能力，还因偶联效率不均和后续纯化步骤导致抗体产量下降、生产成本升高。此外，在多重免疫荧光成像中，由于荧光显微镜可分辨的光谱通道通常限制在3至4个，单轮染色可检测的生物标志物数量有限。为实现更高水平的多重分析，通常需要迭代染色、信号擦除和重新染色。然而，现有的信号去除策略，如使用严苛还原或酸性条件的抗体洗脱，以及氧化漂白的荧光淬灭，常导致组织形态损伤和表位完整性受损，严重影响染色保真度并限制多重分子分析的深度。尽管CODEX和Exchange-PAINT等先进技术通过DNA条形码偶联抗体实现了数十种靶标的多重分析，但这些方法仍需复杂的DNA寡核苷酸设计、杂交条件优化和探针剥离流程，且DNA偶联抗体的制备仍依赖化学修饰，继承了上述传统标记方法的诸多局限。因此，开发一种可控、非破坏性的荧光信号去除方法，并简化可擦除标记与迭代成像的实验流程，仍是该领域亟待解决的关键问题。

二、研究内容与核心结论

针对上述挑战，研究人员开发了基于蛋白酶可切割纳米抗体-荧光蛋白融合体（Nanobody-Fluorescent Protein Fusions, NFPFs）的可逆免疫染色平台。该平台将靶标特异性纳米抗体（Nanobody, NB）、烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶识别位点和荧光蛋白整合于单一重组多肽中，实现无需合成后化学修饰的基因编码染色试剂生产。研究人员构建了靶向HER2的HER2-mNeonGreen和靶向EGFR的EGFR-mCherry两种NFPFs，并系统验证了其重组表达、靶标结合特性、细胞染色能力、TEV介导的荧光去除效率及顺序免疫染色适用性。研究结果表明，HEK293细胞表达的NFPFs具有纳摩尔级的高靶标亲和力（HER2-mNeonGreen的K_d为1.85 nM，EGFR-mCherry的K_d为1.7 nM），能够对Capan-1细胞实现稳健的浓度和时间依赖性免疫染色。TEV蛋白酶介导的切割可在温和条件下（4 °C，2.5 U μg^-1，9小时）近乎完全去除荧光信号，同时保持细胞形态和抗原可及性。顺序标记HER2和EGFR受体的实验证明，无论染色顺序如何，均可实现同一标本内的迭代免疫染色。该研究的重要意义在于提供了一种简单、可扩展且高度模块化的可逆成像探针平台，避免了传统化学偶联的复杂性，为多重荧光分子成像提供了新的技术路径。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）基因工程融合蛋白设计与真核表达系统，通过HEK293细胞瞬时转染实现NFPFs的分泌表达与Ni-NTA亲和纯化；2）酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）和生物层干涉法（Bio-Layer Interferometry, BLI）分别用于评估NFPFs的靶标结合能力与结合动力学参数；3）尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography, SEC）用于分析蛋白纯度；4）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用于表征TEV蛋白酶切割效率；5）基于固定Capan-1细胞的免疫染色与荧光显微成像，结合ImageJ定量分析评估染色与荧光去除效果。样本来源为Capan-1胰腺腺癌细胞系和HEK293细胞系。

四、研究结果

4.1 NFPFs的表达与表征

研究人员设计了N端至C端依次为纳米抗体、柔性(G₄S)₂连接肽、TEV蛋白酶识别序列ENLYFQ↓S、第二段柔性连接肽、荧光蛋白及C端His标签的融合蛋白架构。通过比较原核和真核表达系统，发现大肠杆菌（E. coli）表达的NFPFs靶标结合能力显著降低（EGFR-mCherry EC₅₀约1.89 μg ml^-1，HER2-mNeonGreen约2.85 μg ml^-1），而HEK293细胞表达产物则保持高亲和力（EGFR-mCherry EC₅₀约0.01 μg ml^-1，HER2-mNeonGreen约0.027 μg ml^-1），推测与原核表达系统中纳米抗体结构域折叠不佳有关。HEK293瞬时表达获得HER2-mNeonGreen 1.53 mg ml^-1（纯度87.39%）和EGFR-mCherry 10.3 mg ml^-1（纯度88.87%）。BLI分析显示两种NFPFs均呈现浓度依赖性结合动力学，1:1朗缪尔模型拟合获得HER2-mNeonGreen的K_d为1.85 nM、EGFR-mCherry的K_d为1.7 nM，与先前报道的游离纳米抗体亲和力相当，表明融合荧光蛋白未损害靶标识别。SDS-PAGE分析显示，TEV蛋白酶切割效率与酶剂量和孵育时间正相关，2.5 U μg^-1 TEV在30 °C下2小时即可实现近乎完全切割，4 °C下需约3小时。上述结果表明HEK293表达的NFPFs保留高亲和力靶标识别，并支持TEV介导的荧光蛋白结构域高效去除。

4.2 免疫染色与荧光去除的优化

研究人员使用Capan-1细胞（共表达HER2和EGFR，HER2密度约为EGFR的5倍）优化NFPF染色条件。在约70%汇合度下，1 μg ml^-1 HER2-mNeonGreen于4 °C孵育16小时产生约9 a.u.的平均荧光强度，而10 μg ml^-1 EGFR-mCherry产生约2.5 a.u.的较低强度，差异与两种受体的相对丰度及mNeonGreen较mCherry约4倍更高的固有亮度一致。两种NFPF的荧光信号均随时间延长而增强，后续实验采用过夜孵育。对照实验显示游离荧光蛋白孵育4小时无可检测的非特异性结合。细胞表面TEV切割优化中，30 °C处理虽可高效去除信号，但导致细胞脱落和NFPF解离加速，因此改用4 °C条件。2.5 U μg^-1 TEV于4 °C处理下，HER2-mNeonGreen标记细胞的残余荧光在6小时降至对照的约23%，约9小时完全不可检测；EGFR-mCherry标记细胞在6小时即实现近乎完全去除。明场成像确认蛋白酶处理后细胞形态基本保持。当两种NFPF共标记细胞经优化条件处理后，两种荧光信号均变为不可检测。光漂白实验表明，在既定采集参数下10秒连续成像仅损失约16%信号，远低于TEV切割导致的信号下降，排除了光漂白对切割实验结果的干扰。这些结果证明TEV介导切割可在温和条件下选择性且近乎完全地去除荧光报告分子。

4.3 迭代免疫染色

研究人员设计了交替进行NFPF染色和TEV蛋白酶处理的迭代标记流程。Capan-1细胞首先以HER2-mNeonGreen标记，经2.5 U μg^-1 TEV于4 °C处理9小时擦除绿色荧光信号后，同一细胞再以EGFR-mCherry重新标记，产生红色荧光并经第二次TEV处理去除。反向顺序（先EGFR-mCherry后HER2-mNeonGreen）的流程同样成功。两种顺序中荧光信号均被依次产生和擦除，证明迭代受体检测与标记顺序无关。蛋白酶处理后细胞可被重新标记，表明TEV介导切割选择性去除荧光报告分子而不损害受体可及性，为后续免疫染色提供了保障。

五、讨论与结论

讨论部分指出，NFPF平台将靶标识别纳米抗体、TEV可切割肽段和荧光蛋白整合为单一基因编码融合试剂，可通过细胞工厂简便生产，仅需一步SEC纯化即可获得高纯度产物，避免了化学偶联的多步繁琐流程。该平台具有高度模块化的即插即用特性，纳米抗体和荧光蛋白结构域均可独立灵活更换，通过组合不同靶标纳米抗体与多种荧光蛋白（如mNeonGreen、mCherry、mClover3、mScarlet-I或mCardinal），可定制针对特定迭代成像需求的正交NFPF组合。研究选择纳米抗体作为工程化对象，因其是最小的天然抗原结合片段，仅含单一免疫球蛋白结构域，较单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）和抗原结合片段（fragment antigen-binding, Fab）具有更优异的稳定性，可在热和pH胁迫下保持纳摩尔甚至皮摩尔级的高特异性和亲和力，且具有低毒性和低免疫原性。由于所用纳米抗体解离半衰期相对较短，染色后需快速冲洗并立即成像，高浓度NFPF染色可驱动结合平衡趋向受体饱和以补偿快速解离速率。柔性G₄S连接肽赋予纳米抗体和荧光蛋白空间自主性，减少位阻并增强切割基序的可及性，但也可能带来超分辨成像中运动模糊和对内源蛋白酶敏感性增加等潜在权衡。TEV蛋白酶凭借其卓越的序列特异性（识别ENLYFQG，在Q和G之间切割）和4 °C活性，适用于温度敏感靶标的处理，未来可考虑以人鼻病毒（Human Rhinovirus, HRV）3C蛋白酶替代TEV以加速低温下的切割动力学。

研究结论部分：本研究开发了蛋白酶可切割NFPFs作为迭代免疫染色的可逆平台。TEV蛋白酶切割位点的引入使得在温和条件下高效去除荧光成为可能，同时保持靶标可及性和样品完整性。这种基因编码、模块化的策略避免了合成后化学偶联，可便捷地适配多种纳米抗体和荧光蛋白，为下一代可逆成像探针提供了通用基础。未来工作将聚焦于扩展NFPF平台至更多分子靶标、寻找切割效率更高的蛋白酶，以及开发适用于体内分子成像的优化NFPFs。