表面引发聚合物刷的物理化学性质对siRNA结合与转染效率的影响

《Biomaterials Science》：Impact of the physico-chemical properties of surface-initiated polymer brushes on siRNA binding and transfection efficiencyOpen Access

　　

聚阳离子基因递送载体的合理设计需要理解聚合物化学如何调控RNA复合（complexation）、细胞摄取（cellular uptake）和胞内释放动力学（intracellular release kinetics）。研究发现，聚（甲基丙烯酸二甲氨基乙酯）（poly(dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA）刷在siRNA递送中展现出显著潜力，具有高敲低效率（knockdown efficiency）和低细胞毒性（cytotoxicity）。然而，更广泛聚合物刷的物理化学性质（physico-chemistry）对RNA递送的影响尚未得到探索。研究人员利用涵盖叔胺（tertiary amine）和季铵（quaternary ammonium）化学的10种阳离子聚合物刷文库，揭示了疏水性（hydrophobicity）、pKa、链刚性和季铵化（quaternisation）如何调控siRNA递送和基因沉默（gene silencing）。结合椭圆偏振光谱法（ellipsometry）和表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR），研究人员发现RNA结合能力与刷的pH响应性（pH-responsiveness）和链刚性直接相关。短甲基基团的季铵化从根本上改变了结合机制，消除了pH敏感性，同时提高了胶体稳定性（colloidal stability）并降低了细胞毒性。为研究物理化学性质对转染效率的影响，研究人员通过共聚焦显微镜（confocal microscopy）和流式细胞术（flow cytometry）检测了刷-RNA复合物的摄取，并使用竞争性结合显微分析（competitive binding microscopic assay）定量了胞质释放（cytosolic release）。研究人员观察到刷物理化学性质对释放动力学的影响与长期沉默效率之间存在极佳相关性。值得注意的是，研究人员发现刷内RNA的结合能力并不总是与细胞内化（cellular internalisation）、竞争性脱附（competitive desorption）和转染效率相关：刚性咪唑刷尽管结合的RNA远少于聚（烷基胺甲基丙烯酸酯）刷，却实现了稳健的基因沉默。这些发现扩展了递送载体设计空间，为实现受控RNA递送动力学的下一代聚合物载体的合理工程化奠定了基础。

论文解读：表面引发聚合物刷理化性质对siRNA递送与转染效率的系统性研究

**研究背景与问题**

基因治疗的发展为精确调控基因功能带来了前所未有的机遇。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）途径实现序列特异性基因沉默，在遗传病治疗中具有广阔前景。截至2026年，已有八种siRNA药物获批上市，但其中七种依赖N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶联策略靶向肝脏，仅有ONPATTRO采用脂质递送载体。RNA递送面临多重生物学屏障：酶降解敏感性、与生物大分子的非特异性相互作用、细胞摄取不足、内涵体逃逸受限以及胞内释放不充分等。聚合物刷通过表面引发的可控自由基聚合生成，具有厚度、分子量和接枝密度等参数的高度可控性，为系统研究聚合物化学结构如何影响RNA捕获、释放和转染效率提供了理想平台。此前研究主要集中于PDMAEMA刷及其季铵化衍生物，更广泛聚阳离子刷化学对RNA递送的影响尚未得到系统探索。

**研究内容与总体发现**

研究人员合成了涵盖叔胺和季铵化学的10种阳离子聚合物刷文库，系统地研究了疏水性（甲基至异丙基取代基）、pKa（约5至7）和链刚性（柔性烷基与刚性杂环胺）对siRNA结合、释放动力学、细胞内化和基因沉默效率的影响。研究揭示，转染效率由结合、内化和胞内释放之间的协同作用共同决定，最大RNA结合容量并不总是带来最优转染性能。qPVIM刷尽管结合RNA能力远低于聚甲基丙烯酸烷基胺刷，却实现了持续性的基因沉默，这一发现挑战了优先追求高结合能力的传统设计范式。

**主要关键技术方法**

研究人员采用表面引发原子转移自由基聚合（surface-initiated atom transfer radical polymerisation，SI-ATRP）合成聚合物刷；利用椭圆偏振光谱法表征干厚度与pH响应性溶胀行为；使用热重分析（TGA）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认刷化学组成；通过表面等离子体共振（SPR）定量siRNA结合容量；运用动态光散射（DLS）评价纳米颗粒胶体稳定性。功能性实验中，使用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）（LONZA，pooled C2519A），以全细胞裂解液进行竞争性结合实验评估释放动力学，结合流式细胞术和共聚焦显微镜量化细胞内化与溶酶体共定位。

**研究结果**

**聚合物刷的合成与化学表征：** 成功合成了PDMAEMA、PDEAEMA、PDIPAEMA、P2VP和PVIM刷，除PVIM外均实现约30 nm目标厚度。PDIPAEMA呈现极大分子量（203 kDa）和低接枝密度（0.09 chains per nm2）。碘甲烷季铵化处理后，PDIPAEMA发生显著脱接枝和水解，该体系被排除出后续研究。

**溶胀行为的椭圆偏振光谱表征：** 叔胺刷溶胀高度依赖pH。PDMAEMA在pH 7.4 PBS中溶胀至80 nm；PDEAEMA和PDIPAEMA仅在pH 5.5以下充分溶胀；P2VP在pH 4时溶胀程度与PDMAEMA相当。季铵化后所有刷的pH响应溶胀行为消失。

**刷功能化纳米颗粒的胶体稳定性：** PDIPAEMA和P2VP在生理pH下形成大聚集体（≥1.5 μm）。PVIM季铵化后胶体稳定性显著改善，而P2VP因季铵化程度有限，聚集问题未获解决。

**RNA与阳离子聚合物刷的结合：** SPR显示RNA结合容量与质子化水平和溶胀程度正相关。在pH 7.4条件下，PDMAEMA的siRNA表面密度最高（3.9 μg cm?2），低pKa刷结合量显著降低（PDIPAEMA仅0.04 μg cm?2）。季铵化使qPDMAEMA结合量降至1.8 μg cm?2，qPDEAEMA未受影响（2.3 μg cm?2）。刚性刷qPVIM结合量极低（0.05 μg cm?2），表明链刚性限制RNA深部渗透。

**RNA竞争性脱附受刷化学调控：** 全细胞裂解液竞争性实验表明，qPDMAEMA释放慢于PDMAEMA；qPVIM虽然结合量最低，但释放显著延迟，表明表面吸附RNA结合更为紧密。

**聚阳离子刷的转染与敲低效率：** 在HUVECs中靶向PECAM-1的敲低实验中，PDMAEMA和PDEAEMA在转染后第3天分别将蛋白表达降至11%和24%。低pKa刷（PDIPAEMA、P2VP、PVIM）未观察到显著敲低。所有季铵化刷均实现有效敲低。qPDEAEMA因疏水性降低，细胞毒性较PDEAEMA明显减轻。长期研究（14天）显示qPVIM在转染后第7天和第10天仍维持54%和59%的蛋白抑制水平，而PDMAEMA和阳性对照LP3000已恢复表达，qPVIM展现出独特的长效持续沉默特征。

**阳离子聚合物刷纳米颗粒介导的RNA内化：** 流式细胞术显示PDMAEMA的内化效率最高（97% Cy5阳性细胞）。qPVIM尽管SPR结合量低近40倍，却实现了与qPDMAEMA相当的内化水平，呈现出极高的内化/结合比。共聚焦显微镜证实RNA递送至非溶酶体胞质区室，各化学体系间Pearson共定位系数相近（约0.5–0.6）。

**讨论总结与结论**

该研究建立了聚合物刷化学结构与RNA递送性能之间的系统性设计规则。第一，最大RNA结合容量并非转染性能的决定因素——刚性咪唑刷qPVIM的成功表明，可控释放和高效内化可补偿低结合容量。第二，季铵化消除了pH依赖性并开辟独立设计维度，可分别调控结合容量、脱附动力学和细胞毒性谱。第三，疏水性与毒性呈非单调关系：乙基链有毒性而异丙基链无毒，反映刷构象和胶体稳定性对亲水-疏水平衡的敏感性。第四，该研究证实了PDMAEMA之外多种有效敲低化学的存在，为设计具有定制化早期及持续基因沉默时间特征的递送载体提供了基础，对需要精确时间依赖性基因调控的治疗应用具有重要意义。