基于功能化病毒样颗粒（VLPs）控制非持久性蚜传植物病毒的纳米生物技术策略

《Annals of Applied Biology》：A nanobiotechnological approach to control non-persistent aphid-transmitted plant viruses, based on functionalized virus-like particles

　　

中文翻译摘要 针对由蚜虫以非持久方式传播的植物病毒，其防控措施主要依赖于物理屏障、光选择性屏障、反射性地膜以及寄主植物抗性等预防手段。然而，这些方法并非总是持久有效，且由于蚜虫降落到植物表面并立即试探取食时，传播过程仅在数秒内完成，因此田间实施难度较大。目前，尚无可基于病毒-媒介分子相互作用来阻断非持久性病毒传播过程的可用策略。本研究工作中，研究人员工程化了一种源自马铃薯Y病毒科（potyvirus）的病毒样纳米颗粒（VLP），旨在干扰芜菁花叶病毒（TuMV）和小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）这两种马铃薯Y病毒科病毒经由其蚜虫媒介的传播过程。利用该工程化构建体，研究人员发现其对黄瓜花叶病毒（CMV）这一香石竹潜隐病毒科（cucumovirus）病毒的传播同样具有干扰作用。该纳米颗粒是一种融合蛋白，由TuMV辅助成分-蛋白酶（HC-Pro）的修饰版本与外壳蛋白（CP）融合而成。该构建体通过在本氏烟（Nicotiana benthamiana）植物中的瞬时表达递送至蚜虫体内，随后由蚜虫获取。在获取病毒之前，该工程化构建体在蚜虫口针角质层内的滞留，使香石竹潜隐病毒科病毒和马铃薯Y病毒科病毒的传播率分别降低了38%至56%。这种新颖的生物技术方法靶向于对蚜虫介导的非持久性病毒传播过程进行干扰。该遗传构建体适用于稳定整合至转基因植物中，或通过使用适当的表面活性剂或润湿剂直接喷洒至植物叶片上，因此代表了一种用于防控虫媒病毒的有效策略。

论文解读文章

研究背景与科学问题

植物病毒是导致作物减产的主要病原因素之一。由于病毒依赖宿主细胞进行复制，化学防治手段难以在不影响植物正常代谢的前提下有效发挥作用。植物遗传抗性是管理病毒病的有效方法，但新病毒病理型的不断涌现限制了长期抗性的持久性。大多数植物病毒依赖节肢动物（主要是昆虫）进行水平传播，因此，干扰病毒由其媒介传播成为替代性防控策略的重要方向。其中，由蚜虫以非持久性（NP）方式传播的病毒尤为突出，因为这类病毒在蚜虫着陆并开始试探取食的数秒内即可完成传播，使得所有现有的防控措施都来不及干预。NP传播的特点是获取和接种时间极短（数秒），滞留期也短（数小时）。目前，针对NP传播病毒，尚无基于病毒-媒介分子相互作用的可行阻断策略。已有的研究显示，马铃薯Y病毒科（potyviruses）和香石竹潜隐病毒科（cucumoviruses）可能共享蚜虫口针内的结合位点，这为开发广谱干扰策略提供了理论基础。因此，本研究旨在设计一种基于病毒样颗粒（VLP）的纳米生物技术方法，通过竞争蚜虫口针内的特异性病毒滞留位点，来干扰NP型蚜传病毒的传播过程。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员工程化了四种不同的遗传构建体，它们均表达一种由芜菁花叶病毒（TuMV）的辅助成分-蛋白酶（HC-Pro）和外壳蛋白（CP）组成的融合蛋白。通过对HC-Pro的蛋白酶活性位点和切割位点进行突变，获得了能够形成稳定共价连接的HC-Pro-CP融合蛋白的构建体（特别是蛋白酶突变构建体，PMC）。研究人员将PMC构建体通过农杆菌浸润法在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中瞬时表达，并在蚜虫获取病毒之前，使其先行获取并滞留在蚜虫口针内。实验结果表明，预先获取PMC可显著降低桃蚜（Myzus persicae）对TuMV和小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）的传播效率约50%，并对黄瓜花叶病毒（CMV）的传播效率降低约40%。这一发现具有重要意义，因为它首次展示了一种基于功能化VLP的策略能够同时干扰不同属（马铃薯Y病毒科和香石竹潜隐病毒科）的非持久性蚜传病毒，表明该类病毒在蚜虫口针内可能存在共同的或空间邻近的受体位点。该策略有望发展为稳定的转基因植物表达或直接喷洒制剂，为环境友好型病毒防控开辟了新途径。

关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术。首先，通过基因合成和克隆技术，构建了包含TuMV HC-Pro与CP融合序列的四个遗传构建体，并利用农杆菌浸润法（agroinfiltration） 在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中进行瞬时表达。其次，采用间接酶联免疫吸附试验（Indirect ELISA） 和蛋白质印迹法（Western Blot） 检测目标蛋白的表达与加工情况。第三，利用透射电子显微镜（TEM） 观察并确认病毒样颗粒（VLP）的形成与形态。第四，进行了系统的蚜虫介导的病毒序贯传播实验：将饥饿处理的桃蚜（Myzus persicae）先置于表达PMC的本氏烟叶片上获取5分钟，再转移至感染TuMV、ZYMV或CMV的毒源植物上获取5分钟，最后将其接种到健康的测试植物（芜菁或西葫芦）上24小时，通过统计发病率和ELISA检测评估传播率变化。此外，还运用了AlphaFold2进行计算机模拟结构预测，分析了HC-Pro同源二聚体的三维结构。

研究结果

3.1 工程化具有不同HC-Pro版本的TuMV VLPs

研究人员设计了四个遗传构建体（NMC、PMC、LMC、PLMC）。通过Western Blot分析发现，非突变构建体（NMC）和连接肽突变构建体（LMC）中的HC-Pro蛋白酶仍具活性，会从融合蛋白上切割释放出游离的HC-Pro。而蛋白酶突变构建体（PMC）则未检测到游离HC-Pro，表明其蛋白酶活性被成功灭活。TEM观察证实，所有构建体均能在本氏烟叶片中形成柔性的丝状VLP，但PLMC构建体形成的VLP尺寸较小且数量较少。结论：通过突变HC-Pro的蛋白酶活性位点（PMC），成功阻止了融合蛋白的自我切割，形成了HC-Pro共价连接于CP表面的功能性VLP。

3.2 使用TuMV-VLPs对NP传播病毒的干扰作用

传播实验结果显示，预先获取NMC不能降低TuMV的传播率，甚至略有增加。相反，预先获取PMC后，TuMV的传播率相比对照组（直接获取病毒或先获取空载植株）显著降低了约50%。在后续实验中，预先获取PMC同样显著降低了ZYMV的传播率（从83%降至48.9%），并使CMV的传播率降低了约40%（从44.7%降至27.7%）。结论：PMC构建体能够有效干扰多种NP型蚜传病毒（包括马铃薯Y病毒科的TuMV和ZYMV，以及香石竹潜隐病毒科的CMV）的传播，其机制可能是通过与蚜虫口针内共同或邻近的受体位点竞争性结合来实现的。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究的结果支持了此前关于马铃薯Y病毒科和香石竹潜隐病毒科病毒可能共享蚜虫口针内滞留位点的假说。PMC构建体的有效性在于其形成了表面展示大量HC-Pro单体的功能化VLP，这些单体可能以“类二聚体”的形式与蚜虫口针受体（推测为stylin蛋白）高效结合，从而物理性阻断了后续野生型病毒粒子的附着。未能实现100%阻断的原因可能包括：农杆菌浸润后植物组织中构建体表达不完全均匀，以及蚜虫在毒源植物上取食时唾液分泌可能导致部分结合的VLP脱落。作者强调，该策略具有广谱应用的潜力，可通过开发稳定表达PMC的转基因植物或制备可直接喷洒的可溶性PMC制剂来实现田间应用。

研究结论：本研究证明，通过在植物中瞬时表达一种工程化的马铃薯Y病毒科HC-Pro-CP功能化纳米颗粒（PMC），可以有效降低三种NP型蚜传病毒——TuMV、ZYMV和CMV的传播率。这种创新的生物技术方法靶向于病毒-媒介互作的关键环节，为开发新型、环境友好的植物病毒防控策略奠定了基础。