《Virologica Sinica》：Monocyte-associated C1q upregulation and complement activation contribute to vascular endothelial and multi-organ injury in severe dengue
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登革病毒（DENV）感染引起广泛的临床表现，从自限性登革热（DF）到危及生命的重症登革热（SD）。血管通透性增加和内皮功能障碍是SD的标志性特征，导致血浆渗漏、休克和多器官损伤，但其潜在机制尚不完全清楚。在本研究中，研究人员整合了不同疾病阶段登革热患者外周血单
登革病毒（DENV）感染引起广泛的临床表现，从自限性登革热（DF）到危及生命的重症登革热（SD）。血管通透性增加和内皮功能障碍是SD的标志性特征，导致血浆渗漏、休克和多器官损伤，但其潜在机制尚不完全清楚。在本研究中，研究人员整合了不同疾病阶段登革热患者外周血单个核细胞（PBMCs）的动态bulk和单细胞RNA测序数据，以探究与疾病进展相关的机制。补体相关特征在伴有警示征的登革热（DWS）和SD患者中显著改变，其中单核细胞成为C1Q基因（C1QA、C1QB和C1QC）表达增加的主要细胞来源。这些发现提示单核细胞来源的C1q和经典补体通路激活参与了登革热的进展。利用重症登革热小鼠模型，研究人员进一步证实了全身性补体激活以及末端补体效应物膜攻击复合物（MAC）的沉积，这与微血管内皮损伤和多器官损伤相关。重要的是，用C1INH（C1酯酶抑制剂）抑制经典补体通路可显著减轻重症登革热小鼠的血管屏障功能障碍和多器官损伤。综上所述，研究人员的发现确定了单核细胞来源的C1q和失调的经典补体激活是SD中血管内皮和多器官损伤的重要促成因素，并提示靶向经典补体通路可能代表一种治疗重症登革热的潜在策略。
研究背景与科学问题
登革病毒（DENV）是最重要的蚊媒病原体之一，包含四种血清型（DENV1–4），在全球130多个热带和亚热带国家流行，每年约造成4亿例感染。人类DENV感染导致一系列临床结局，从自限性的登革热（DF）到危及生命的重症登革热（SD），后者包括登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）。每年约有5000万至1亿例有症状的登革热病例报告，其中300万至600万例进展为SD。2023年，全球80个国家记录了超过500万例DF病例，导致5000多例SD相关死亡。然而，由于抗体依赖性增强（ADE）等挑战以及对病毒受体认识的局限，目前尚无针对DENV的特异性抗病毒药物或普遍安全有效的疫苗。尽管ADE长期以来被认为是异源性二次DENV感染期间疾病加重的重要机制，但它不能完全解释SD复杂的血管和全身表现。越来越多的证据表明，失调的宿主免疫反应，特别是补体系统的过度激活，与登革热的疾病严重程度和血管渗漏密切相关，提示补体过度激活可能是SD发病机制中被低估的关键因素。SD的标志是血管通透性急剧增加，导致血浆渗漏、出血倾向，并可能进展为休克和多器官衰竭。血管内皮形成控制血管完整性的关键屏障，在这一致病过程中处于核心地位。广泛的内皮功能障碍和损伤被认为是SD发病机制的基石，引发级联事件导致全身性血管渗漏。值得注意的是，在重症登革热中一直观察到补体激活，补体衍生的炎症介质和末端补体激活可能直接或间接损害内皮完整性并促进血管高通透性。然而，将DENV感染与广泛内皮损伤及其后续远隔器官衰竭联系起来的精确分子机制仍未完全阐明。因此，阐明补体过度激活在内皮屏障破坏和全身性血管渗漏中的作用，可能为SD的发病机制提供重要见解，并为预防疾病进展确定潜在的治疗靶点。
研究内容与主要结论
本研究通过整合不同疾病阶段登革热患者外周血单个核细胞（PBMCs）的动态bulk和单细胞RNA测序数据，结合重症登革热小鼠模型，揭示了单核细胞来源的C1q驱动的经典补体通路异常激活是SD中血管内皮和多器官损伤的关键驱动因素。研究发现，DWS和SD患者PBMCs中经典补体通路相关特征显著改变，单核细胞是C1Q基因（C1QA、C1QB和C1QC）表达增加的主要细胞来源。在重症登革热小鼠模型中，研究人员证明了全身性补体激活和末端补体效应物膜攻击复合物（MAC）的沉积与微血管内皮损伤和多器官损伤相关。使用C1INH（C1酯酶抑制剂）抑制经典补体通路可显著减轻血管屏障功能障碍和多器官损伤。这些发现表明，靶向经典补体通路可能是一种治疗重症登革热的潜在策略。
主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：1）动态bulk RNA-seq分析：对来自GSE279208数据集的16例登革热患者和10例健康对照者的PBMCs进行高通量RNA测序转录组分析；2）单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析：对来自GSE220969数据集的20例DENV感染儿童和4例健康对照者的PBMCs进行分析；3）重症登革热小鼠模型：通过尾静脉注射1×105 PFU的DENV2（N10株）感染6-8周龄IFNAR-/-小鼠建立模型；4）C1INH干预实验：从感染后第1天起每日腹腔注射C1INH；5）免疫荧光共定位分析；6）Evans蓝血管通透性测定；7）ELISA检测血清C3水平；8）RT-qPCR检测基因表达；9）H&E染色组织病理学分析；10）ImageJ图像定量分析。
研究结果
动态多组学揭示DWS和SD患者单核细胞经典补体通路的异常激活
通过对GSE279208数据集的分析，研究人员发现Cluster 2和Cluster 4中富集的基因在DWS和SD患者中显著上调，其中多个补体相关GO条目在Cluster 2中显著富集，尤其是经典补体通路相关条目。统计分析显示，经典补体通路激活相关因子（C1QA、C1QB、C1QC、C1R）的表达水平在患者PBMCs中显著上调，而替代和凝集素补体通路的因子无显著变化。进一步通过scRNA-seq分析GSE220969数据集，发现随着疾病恶化，患者外周血中单核细胞的数量和比例显著增加。更重要的是，C1Qs主要在登革热患者的单核细胞中表达，且DWS和SD患者中表达C1Q的单核细胞显著增加。Pearson相关性分析显示C1Q基因在这些细胞中基本共表达。此外，对末端补体/MAC相关基因的分析表明，SD中增强的组织MAC沉积并非伴随循环血细胞中末端补体成分的广泛转录上调。
动态scRNA-seq揭示C1Q-high单核细胞是DWS和SD患者免疫细胞通讯的核心角色
ClusterGVis分析显示，与D和DWS患者相比，SD患者的PBMCs和单核细胞中抗病毒相关GO条目均失活。Monocle3拟时间轨迹分析表明，DWS和SD患者表现出不同的终末分化状态，沿单核细胞分化轨迹表达显著变化的基因大多与抗病毒免疫相关。通过将DWS和SD患者的单核细胞分为C1Q-high和C1Q-low亚群并进行比较分析，发现C1Q-high单核细胞亚群在多种细胞组分和生物学过程相关条目中表现出独特特征。CellChat分析揭示，在DWS和SD患者中，C1Q-high单核细胞的信号强度在传出和传入模式上均显著强于大多数其他免疫细胞类型，并且作为关键的信号发送者和接收者介导了DWS和SD患者PBMCs特有的不同通路的激活，包括SD患者中的IL1信号通路，其中C1Q-high单核细胞作为IL1信号通路的唯一发送者分泌促炎细胞因子IL1B。
经典补体通路的异常激活损害SD小鼠多器官的血管内皮屏障功能
通过在重症登革热小鼠模型中进行免疫荧光共染，研究人员发现MAC与关键血管屏障蛋白Occludin（OCLN）在肝脏、脑和脾脏中存在大量共定位，且OCLN呈现不连续分布模式。此外，在多个器官实质中也观察到MAC沉积。C1INH处理显著减少了器官MAC沉积，恢复了OCLN的连续线性分布。空间分布分析显示，约75%的MAC阳性区域位于微血管0-10 μm范围内，呈现明显的血管周围分布特征。Evans蓝通透性实验表明C1INH处理有效减弱了感染引起的组织血管通透性增加。ELISA结果显示SD小鼠血清C3水平显著降低，C1INH处理后略有回升。RT-qPCR证实SD小鼠中补体激活主要通过经典通路发生。
抑制经典补体通路激活显著减轻SD小鼠的多器官损伤
H&E染色和相邻切片的免疫荧光分析显示，在多个器官中，尤其是肝脏和脾脏，MAC沉积的分布和形态与实质细胞损伤区域紧密吻合。C1INH处理不仅显著减少了SD小鼠各器官的MAC沉积，还明显减小了病变区域的面积。定量分析确认C1INH处理显著降低了SD小鼠器官的病变面积比。凋亡标志物caspase-3的评估表明，C1INH处理在转录和翻译水平上均显著降低了SD小鼠多个器官中caspase-3的表达。病毒载量分析显示，C1INH处理的动物在全血和多个器官中的病毒载量数值上较低，但仅在肝脏中观察到统计学显著性。
讨论与结论
本研究表明，通过整合动态多组学数据和IFNAR-/-小鼠模型，单核细胞来源的C1q介导的经典补体通路激活是SD中血管内皮和多器官损伤的关键驱动因素。研究发现经典补体通路激活是SD患者的重要免疫特征，单细胞测序鉴定出单核细胞来源的C1q是驱动这一激活的主要因素，并且这些单核细胞表现出抗病毒免疫抑制特征，C1Q-high亚群成为PBMCs信号相互作用的关键节点。研究结果确立了C1Q-high单核细胞驱动的经典补体激活是SD的一个决定性免疫学特征。重要的是，用C1INH抑制经典补体通路可显著减轻重症登革热小鼠的血管屏障功能障碍和多器官损伤。综上所述，研究人员的发现确定了单核细胞来源的C1q和失调的经典补体激活是SD中血管内皮和多器官损伤的重要促成因素，并提示靶向经典补体通路可能代表一种治疗重症登革热的潜在策略。
