《Translational Research》：Performance Characteristics for Flow Cytometric Enumeration of Peripheral Blood Lymphocyte Subsets under Harmonized Laboratory Conditions: A Multicenter Study
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背景：流式细胞术外周血淋巴细胞亚群计数（EPBLS）对于疾病管理至关重要，然而目前缺乏标准化的验证标准。研究人员在协调化条件下定义了关键性能特征，以支持相关标准的制定。
方法：研究人员使用来自中国五个地区九家临床实验室的205份全血样本和两个水平的54份质量
背景：流式细胞术外周血淋巴细胞亚群计数（EPBLS）对于疾病管理至关重要，然而目前缺乏标准化的验证标准。研究人员在协调化条件下定义了关键性能特征，以支持相关标准的制定。
方法：研究人员使用来自中国五个地区九家临床实验室的205份全血样本和两个水平的54份质量控制（quality control，QC）样本，采用基于计数微球的流式细胞术单平台（single-platform，SP）方法测量淋巴细胞亚群的绝对计数（absolute counts，AC）和相对计数（relative counts，RC）。基于2,865次测量，并结合一致性相关系数（concordance correlation coefficient，CCC）、Passing-Bablok回归以及Bland-Altman图的综合统计学方法，对性能特征进行了评估。
结果：研究人员建立了涵盖主要临床相关淋巴细胞亚群分布（RC：1.32%–97.53%；AC：3.37–6,846.98 cells/μL）的精密度、可比性和样本稳定性性能特征。批内和批间变异系数（coefficient of variation，CV）对RC分别低于8%和6%，对AC分别低于10%和9%。一个严格的双标准框架（可比性标准：一致性与相关性；偏差标准：绝对最大偏倚阈值<20%），由三重统计学方法支持，确认了试剂批次、实验室间以及储存时间点之间的一致性，并进一步报告了全面的偏倚概况。全血样本在采集后24小时内保持稳定（RC偏倚<14%；AC偏倚≤15%），处理后样本在染色后48小时内保持稳定（RC偏倚<13%；AC偏倚<19%）。
结论：本研究基于协调化的多中心方案并采用分层常规临床样本，为EPBLS建立了一个涵盖精密度、可比性和稳定性的综合性能阈值与双标准评价系统，为实验室验证和质量规范制定提供了实用参考。
论文解读
外周血淋巴细胞亚群包括CD3
+ T、CD4
+ T、CD8
+ T、B和NK细胞，其数量变化与自身免疫病、感染、恶性肿瘤等多种免疫相关疾病的发生发展密切相关。外周血淋巴细胞亚群计数（EPBLS）在免疫状态评估、疾病诊断分型、治疗反应监测、预后判断及健康监测中具有重要临床价值。流式细胞术（FCM）是检测淋巴细胞亚群相对计数（RC）和绝对计数（AC）的主要方法。然而，目前针对FCM-based淋巴细胞亚群检测的性能验证参数缺乏统一标准。已有研究在分析方法上差异较大，多依赖质控材料，且未能完全遵循现行指南建议，尚不足以建立普适性接受标准。因此，亟需基于协调化多中心研究、纳入常规临床样本并采用严格统计学分析的系统性性能特征数据。
研究人员在中国五个地区的九家ISO 15189认可的临床实验室开展了一项多中心评价，采用基于计数微球的单平台（SP）FCM方法分析EDTA抗凝全血样本。共纳入205份全血样本和54份质控样本，覆盖259例样本，产生2,865次测量。样本按淋巴细胞计数被前瞻性分层为极低、低、正常和高四类，涵盖主要临床相关分布范围（RC：1.32%–97.53%；AC：3.37–6,846.98 cells/μL）。研究系统表征了精密度、可比性和稳定性等关键性能参数。结果显示，批内RC和AC的CV分别低于8%和10%，批间RC和AC的CV分别低于6%和9%；试剂批次间和实验室间均表现出高度一致性和相关性，绝对最大偏倚分别在RC<15%/AC<17%和RC<13%/AC<16%范围内；全血样本采集后24小时内稳定，处理后的染色固定样本在4°C下48小时内稳定。该研究建立了涵盖精密度、可比性和稳定性的综合性能阈值和双标准评价体系，为实验室验证和质量规范制定提供了实用参考。
关键方法包括：样本来源于中国五个地区九家ISO 15189认可的临床实验室，包括体检人群及各类患者（如肿瘤、感染、自身免疫病、免疫缺陷及儿童患者），全血样本采用EDTA抗凝，并前瞻性按淋巴细胞计数分层。检测采用标准化的单平台计数微球流式细胞术方案，由中心实验室统一制定仪器设置、样本制备、染色、获取和分析程序，并在各实验室统一实施。性能验证基于每日仪器设置验证和常规内部质控合格后进行。统计方法采用综合三重方法：一致性相关系数（CCC）评估一致性，Passing-Bablok（PB）回归评估相关性，Bland-Altman图评估偏差，并设置绝对最大偏倚<20%作为偏差接受标准；精密度通过变异系数（CV）评估；样本稳定性评估设置恰当基线并联合细胞活力检测。
研究结果
研究设计：259例样本（205份全血和54份质控）覆盖RC 1.32%–97.53%、AC 3.37–6,846.98 cells/μL，共产生2,865次测量，用于评估精密度、可比性和稳定性。
精密度：批内精密度分析54份样本（36份全血、18份质控），共540次测量，所有RC的CV<8%，AC的CV<10%；RC的CV与计数水平呈负相关，而AC无此关联。批间精密度使用两个水平质控品，九家实验室各进行20次重复测量，共360次测量，所有RC的CV<6%，AC的CV<9%。AC的精密度普遍低于RC。
可比性：批间可比性使用三批试剂检测54份样本，共486次测量，以第一批为参考，CCC均>0.99，PB回归显示强相关，绝对最大偏倚RC<15%、AC<17%。实验室间可比性将43份全血样本在三个实验室同时检测，共129次测量，以Lab 1为参考，CCC和PB回归均满足标准，绝对最大偏倚RC<13%、AC<16%。95%一致性界限较窄，均优于指南推荐的变异范围。
稳定性：样本稳定性评估45份全血样本，共675次测量，以采集后<2小时为基线，检测8、24、48、72小时。全血在室温下24小时内稳定，RC绝对最大偏倚<14%，AC≤15%，细胞活力在24小时内保持>95%；48小时部分AC亚群不再满足PB回归标准，72小时偏差显著增大。处理后样本稳定性评估45份样本，共675次测量，以处理后<1小时为基线，染色固定样本在4°C下48小时内稳定，RC绝对最大偏倚<13%，AC<19%；72小时后AC偏差明显增大，不再满足偏差标准。
双标准一致性的交叉验证：将符合可比性和偏差双标准的数据所计算的CV，与独立建立的精密度限值（RC CV<8%，AC CV<10%）进行比较，总体通过率达99.7%，表明双标准判定框架与精密度限值具有高度一致性，可作为准确度验证的实用方法。
讨论部分总结：该研究的方法学优势包括全面协调化方案、分层常规临床样本以及严格的双标准三重统计策略，确保了性能特征的代表性和可靠性。精密度数据为实验室质控提供了可操作的基准；可比性参数支持不同批次和实验室间结果的互认；稳定性数据为样本运输和实验流程提供了明确的时间窗口。研究还观察到AC比RC变异更大，低计数亚群（B、NK细胞）比高计数亚群变异更大，提示未来可采用亚群和指标特异性接受标准。局限性在于结果主要适用于EDTA抗凝样本和基于计数微球的单平台系统，其他抗凝剂或体积计量平台需进一步研究。
结论：本研究在协调化条件下为流式细胞术EPBLS建立了一个全面的评价框架。所得性能特征适用于采用相同EDTA抗凝样本和单平台计数微球工作流程的临床实验室的检测验证，为接受标准的制定提供了科学基础，并支持这些检测在常规实践中的标准化实施。这些性能特征对其他分析系统或抗凝剂的推广性尚需进一步研究；然而，该评价框架整合了协调化流程、分层常规临床样本和具有严格评价标准的稳健统计学策略，可为未来研究提供方法学参考。
