豌豆蛋白提取技术比较研究：湿法提取与干法分馏对澳洲黄豌豆蛋白理化及功能特性的影响及其与商业豌豆和大豆蛋白的对比分析

《Legume Science》：Pea Protein Extraction Techniques: A Comparative Study With Commercial Pea and Soy Proteins

　　

植物蛋白的分离常采用湿法提取和干法分馏两种方式。为确定最适合的工业应用场景，本研究考察了湿法提取和干法分馏对澳洲黄豌豆蛋白理化及功能特性的影响，并与商业豌豆及大豆蛋白分离物进行对比。湿法提取和干法分馏所得豌豆蛋白在蛋白质含量、表面特性、结构及功能特性方面存在显著差异，而二者在必需氨基酸含量上无显著差异。值得注意的是，与高度变性的商业对照样品相比，两种实验室加工的豌豆蛋白组分均保持了更优异的结构完整性。具体而言，与湿法提取的豌豆蛋白分离物相比，干法分馏的豌豆蛋白浓缩物表现出较低的蛋白质变性程度，这反映在其较高的溶解度（77.3%对66.1%）、较低的表面疏水性（345.2对650）以及较小的粒径（314对603 nm）上。相反，湿法提取增强了持水性，而干法分馏则表现出更优异的乳化活性。相比之下，商业豌豆和大豆蛋白分离物变性程度更高，表现为溶解度较低、粒径较大及疏水性较高。最终，这些不同的功能特性表明，提取方法直接决定了蛋白质的最终特性，凸显了针对特定食品工业应用选择最适宜加工方法的重要性。

**论文解读：豌豆蛋白提取技术比较研究**

**1. 研究背景与问题**

随着全球对可持续植物蛋白需求的日益增长，豆类蛋白因其丰富的含量（18%–30%）、良好的营养价值和低致敏性而备受关注。澳大利亚是全球主要的豆类生产国和出口国，其中黄豌豆的年均产量可观。豌豆蛋白主要由球蛋白（globulins，主要为11S豆球蛋白和7S豌豆球蛋白）和白蛋白（albumins）组成，其结构特性（如亚基组成、分子量）影响其功能。目前，植物蛋白的提取主要采用湿法提取（wet extraction）和干法分馏（dry fractionation）两种技术。湿法提取能获得高纯度蛋白分离物（>85%），但能耗高、用水量大、需使用化学品且可能导致蛋白质变性；干法分馏则更为环保，能较好地保留蛋白质天然状态，但产品纯度较低（通常40%–65%）。尽管已有研究分别探讨了这两种方法对豌豆蛋白的影响，但缺乏在相同实验条件下、针对同一原料进行的直接对比研究。此外，实验室制备的蛋白与商业蛋白分离物在结构和功能上的差异，以及澳洲黄豌豆因独特 agro-climatic 条件可能导致的蛋白特性差异，均未被充分研究。因此，开展本项研究以明确提取方法对蛋白质最终特性的决定性影响，并为食品工业选择适宜的加工工艺提供科学依据。

**2. 研究内容与总体结论**

该研究系统性比较了四种蛋白样品的成分、理化、结构和功能特性：实验室湿法提取的豌豆蛋白分离物（WP）、干法分馏的豌豆蛋白浓缩物（DP）、商业豌豆蛋白分离物（CP）和商业大豆蛋白分离物（CS）。研究在完全一致的分析条件下进行，旨在直接对比不同加工历史和精炼程度的蛋白质。主要结论为：提取方法直接决定了蛋白质的最终特性。干法分馏保留了蛋白质更天然的状态，赋予其高溶解度、低疏水性、小粒径和优异乳化活性；湿法提取则提升了蛋白纯度、持水性和吸油性；商业蛋白分离物因经历更强烈的工业加工而高度变性，表现为溶解度低、粒径大、疏水性高和热稳定性差。该研究强调了为特定食品应用匹配正确提取工艺的重要性。

**3. 主要关键技术方法**

研究人员采用了多种技术对蛋白特性进行全面表征。样品来源包括由 Essantis（澳大利亚维多利亚州）提供的澳洲黄豌豆粉及干法分馏浓缩物，以及购自 Bulk Nutrients（澳大利亚塔斯马尼亚州）的商业蛋白分离物。主要方法包括：使用 Bradford 法和 Dumas 法测定蛋白质含量；通过酸水解和 UPLC-PDA 进行氨基酸（AA）谱分析；利用 ANSA 荧光探针和 Zetasizer 分别测定表面疏水性和表面电荷（ζ-电位）；采用 SE-HPLC 分析蛋白质 apparent molecular weight 并计算 7S/11S 比值；使用 FTIR 光谱分析二级结构；通过动态光散射测定粒径；并评估了蛋白质溶解度、持水性（WHC）、吸油性（OBC）、乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）等功能特性。热特性通过 DSC 测定。所有实验均进行三次独立重复，数据采用 ANOVA 和 Tukey 检验进行统计分析，并计算了 Pearson 相关系数。

**4. 研究结果**

**4.1 提取技术和测定方法对蛋白质含量的影响**

研究对比了 Bradford 和 Dumas 两种测定方法。结果显示，Dumas 法测得的蛋白质含量普遍高于 Bradford 法，这归因于 Dumas 法测定总氮含量，可能包含非蛋白氮源，导致高估。就提取方法而言，干法分馏的 DP 蛋白含量最低（Bradford 法 43.6%），而湿法提取的 WP 含量较高（57.46%），商业样品 CP 和 CS 含量最高（59.46% 和 61.93%），反映了其更优化的多步工业加工过程。

**4.2 氨基酸谱**

两种实验室制备的豌豆蛋白（WP 和 DP）的总必需氨基酸（EAA）含量无显著差异（约 36.55% 和 35.02%），表明提取方法未影响其营养价值。但个别氨基酸存在差异，如 WP 中组氨酸和亮氨酸含量更高，而 DP 中苏氨酸含量更高，这可能与提取过程中白蛋白和球蛋白回收比例不同有关。商业大豆蛋白的总 EAA 含量显著低于豌豆蛋白。

**4.3 蛋白质表面特性**

表面疏水性（H₀）测定显示，DP 最低（345.2），WP 居中（650），而商业样品 CP 和 CS 最高（1145 和 1121.6）。高疏水性表明蛋白质发生解折叠和变性，暴露了内部疏水基团。干法分馏保留了白蛋白（其疏水性较低），而湿法提取的等电点沉淀步骤会损失白蛋白。所有蛋白在 pH 7 时均带负电，实验室样品（WP 和 DP）的 ζ-电位绝对值高于商业样品。ζ-电位随 pH 变化，所有样品在 pH 4-5 之间达到等电点。

**4.4 蛋白质物理表征**

SE-HPLC 显示，WP、CP 和 CS 出现了约 35 kDa 的峰，而 DP 没有，这可能表示湿法提取和商业加工导致寡聚体解聚。DP 在低分子量区（~17 kDa）的峰面积更大，表明其保留了更多白蛋白。干法分馏的 DP 具有更高的 7S/11S 比值（2.01），而 WP 较低（0.89），表明提取方法改变了蛋白组分比例。FTIR 分析显示，所有样品中 β-折叠结构含量最高。WP 和 DP 的 β-折叠含量（41.19% 和 42.05%）显著高于商业样品（CP 28.13%, CS 25.79%），而商业样品含有更多的 β-转角和无规则聚集结构，表明其结构更无序。粒径测定表明，DP 粒径最小（314 nm），WP 居中（603 nm），商业样品最大（724-750 nm），表明商业蛋白发生了显著聚集。

**4.5 功能特性**

在 pH 7 时，DP 的溶解度（77.3%）显著高于 WP（66.1%），远高于商业样品（CP 43.56%, CS 48.0%）。高溶解度与低疏水性、小粒径和白蛋白含量高有关。WP 的 WHC（6.0 g/g）高于 DP（4.0 g/g），而商业样品 WHC 最高（~8.5 g/g），这可能与其低溶解度和高聚集度有关。OBC 方面，WP 最高（5.8 g/g），DP 最低（2.4 g/g），这可能与湿法提取导致蛋白解折叠、暴露疏水基团有关。乳化性质方面，DP 的 EAI（14.12 m²/g）最高，与 CS（13.51 m²/g）无显著差异，而 WP 最低（8.47 m²/g）。相反，CP 的 ESI（74.2 min）显著高于其他样品（22.6–28.7 min），表明高乳化活性不等于高乳化稳定性。

**4.6 热特性**

DSC 分析显示，WP 和 DP 出现单一吸热峰，而商业样品无峰，表明其已高度变性。DP 的变性温度（T_d 78.00°C）和焓变（ΔH 1.0262 J/g）均高于 WP（73.28°C, 0.2907 J/g），表明干法分馏的蛋白具有更高的热稳定性和更少的变性程度。

**4.7 相关性分析**

Pearson 相关性分析显示，溶解度与表面疏水性（r=-0.995）及 WHC（r=-0.995）呈高度负相关；疏水性与粒径（r=0.951）和 WHC（r=0.997）呈正相关；粒径与 ΔH（r=-0.998）呈负相关。这些相关性进一步印证了蛋白质变性、聚集与功能特性之间的内在联系。

**5. 总结讨论与结论**

研究结果表明，提取方法是决定蛋白质最终理化与功能特性的关键因素。干法分馏保留了蛋白质的天然结构，产品具有高溶解度、低疏水性、小粒径和优良的乳化活性，适用于需要快速水合和分散性的应用（如蛋白饮料）。湿法提取则获得纯度和 WHC 更高的蛋白，适用于需要保水性的产品（如肉制品）。商业蛋白因加工更剧烈而高度变性，导致功能特性受损。研究明确指出，不存在普遍最优的蛋白原料，选择应基于特定食品应用需求。这一结构-功能关系的阐明为食品制造商提供了重要的理论指导。本研究的主要局限性在于特性是在简化模型体系中测定的，而非真实食品基质中。未来研究需将这些豌豆蛋白组分纳入实际食品配方中，在真实的热和机械加工条件下评估其性能。该研究为澳大利亚黄豌豆蛋白的高值化利用和精准开发提供了坚实的数据基础。