《Lab on a Chip》：A perfusable first-generation endometrial microvascular model to study human spiral artery remodeling in pregnancyOpen Access
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侵袭性胎盘细胞——绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblasts, EVT）重塑母体血管，以满足发育中胎儿的代谢需求。螺旋动脉重塑（spiral artery remodeling, SAR）失调是子痫前期（preeclamp
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侵袭性胎盘细胞——绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblasts, EVT）重塑母体血管，以满足发育中胎儿的代谢需求。螺旋动脉重塑（spiral artery remodeling, SAR）失调是子痫前期（preeclampsia, PE）的特征，这是一种严重的妊娠相关疾病。研究人员开发了一种模块化新方法（new approach methodology, NAM），在聚苯乙烯（polystyrene, PS）微流控芯片中构建人子宫内膜特异性血管网络，以重现复杂的子宫内膜血管微环境，从而研究SAR。研究人员利用人子宫内膜微血管内皮细胞（human endometrial microvascular endothelial cells, HEMEC）和正常人肺成纤维细胞（normal human lung fibroblasts, NHLF）的自组装能力，在培养3天后成功构建了通畅的子宫内膜血管网络。外源性促血管生成因子显著提高了血管密度，同时保持了子宫内膜固有的血管特性。模拟月经周期不同阶段性激素的处理差异性地影响了子宫内膜血管密度、直径、通透性及促血管生成蛋白的内源性分泌。研究人员评估了EVT细胞系HTR8/SVneo和JEG-3的整合潜力。在与JEG-3细胞三培养3天后，研究人员观察到屏障功能下降及凋亡HEMEC数量增加，而HTR8/SVneo诱导的凋亡在整合第1天和第3天之间无统计学显著变化。此外，研究人员证实HTR8/SVneo和JEG-3细胞与HEMEC血管系统及周围血管周围微环境的相互作用存在差异。这些研究表明该模型在研究子宫内膜血管化和EVT重塑方面具有应用价值。
论文解读文章
一、研究背景与意义
胚胎着床后，螺旋动脉经历广泛的重塑过程以增加胎盘血流量，这对满足整个妊娠期胎儿代谢需求至关重要。螺旋动脉重塑（SAR）通过高度调控的相互作用完成，其中被称为绒毛外滋养层细胞（EVT）的侵袭性胎盘细胞暂时替代母体内皮细胞，形成低阻力血管。重塑异常与子痫前期（PE）密切相关，这是美国孕产妇和胎儿发病及死亡的主要原因之一。PE中SAR失调被认为源于EVT与子痫前期微环境之间的复杂相互作用，损害正常SAR并可能构成PE病理学的基础，但其潜在机制仍不清楚。
SAR以两个连续阶段发生：间质型EVT（iEVT）首先侵入并重塑子宫内膜间质，降解血管平滑肌细胞网络并在血管周围沉积纤维蛋白样基质；随后血管内EVT（eEVT）最初形成栓子以减少胎盘血流，并开始暂时替代内皮细胞（EC）单层。iEVT侵袭失调是最广泛研究的发病假说，但该假说仍存争议，许多临床报告未能发现iEVT侵袭深度与PE之间的明确相关性。此外，许多PE患者存在未被EVT侵袭的持续性EC壁，提示PE可能与血管内EVT-EC相互作用紊乱有关，而非仅由iEVT行为决定，这一假说在很大程度上尚未得到充分研究。
伦理考量使得原位研究SAR困难甚至不可能。早产、终止妊娠和流产提供了不同阶段胎盘发育的线索，但很少产生可在实验室长期研究的细胞或组织。动物模型虽有帮助，但缺乏人类组织的特定生理和结构特征。现有体外新型替代方法（NAMs）大多聚焦于识别调控滋养层迁移或血管周围空间重塑的因素，忽视了在SAR中至关重要的血管内重塑。HTR8/SVneo和JEG-3是用于研究SAR的EVT细胞系，已证明它们在影响SAR的机制上存在差异。然而，目前尚无模型成功形成可灌注的子宫内膜血管系统用于SAR研究。此外，其他模型主要依赖人脐静脉内皮细胞（HUVECs），但人子宫内膜内皮细胞与HUVECs在血管生成和炎症信号方面存在差异。
器官芯片（OOC）微流控装置是研究SAR的有前景的方法。研究人员在此采用聚苯乙烯（PS）微流控芯片，利用人子宫内膜微血管内皮细胞（HEMECs）生成模块化、可灌注的子宫内膜特异性血管网络，以定量评估促血管生成因子和外源性激素对SAR介导效应及血管功能的影响。选择PS而非PDMS是因为PDMS会吸收小分子疏水化合物，而子宫内膜细胞功能主要由小分子疏水性性激素驱动，使用PDMS模拟子宫内膜尤为不利。
二、主要关键技术方法
研究人员使用注塑成型的28孔聚苯乙烯（PS）微流控芯片，芯片包含上下培养基储液池和中央通道，中央通道中图案化含有细胞的血纤维蛋白/胶原-I水凝胶。HEMEC购自ScienCell，NHLF购自Lonza，HTR8/SVneo和JEG-3分别购自ATCC。通过差表面张力机制将预凝胶溶液图案化至中央通道，利用HEMEC与NHLF的自组装在3天内形成血管网络。研究采用共聚焦显微镜活细胞成像和免疫荧光染色（VE-cadherin、CD31、CK7）进行结构分析，通过FITC或Texas Red标记的70 kDa葡聚糖进行血管通透性测定，使用FIJI Angiogenesis Analyzer插件和自定义宏进行血管树特征量化，采用人血管生成抗体阵列膜定量分泌蛋白，TUNEL法检测细胞凋亡。
三、研究结果
（一）内皮细胞与成纤维细胞比例影响芯片上子宫内膜血管网络的互连自组装
研究人员测试了五种HEMEC:NHLF比例及不同细胞接种密度。培养3天后，5:1比例是唯一产生高度互连血管网络的条件。与其他比例相比，5:1条件显著增加了总血管长度、连接点数和平均血管直径（p < 0.0001），体积分数较1:1和2:1条件增加2倍。因此后续实验均采用5:1比例。
（二）外源性促血管生成因子改善子宫内膜血管网络形成并维持固有血管特性
研究人员在第1天和第2天分别单独或联合添加VEGF-A、bFGF和S1P。VEGF单独处理未显著影响血管树特征，但显著增加血管通透性。VEGF+bFGF联合显著增加血管直径和体积分数。VEGF+bFGF+S1P三者联合显著增加节段数和连接点数（p < 0.01），体积分数较对照增加2.2倍（p < 0.05），同时维持了血管直径和通透性等关键固有子宫内膜血管特性。因此后续EVT整合研究采用此联合处理。
（三）模拟月经周期不同阶段的激素处理改变子宫内膜血管网络的结构-功能特性
研究人员采用高E2条件（10 nM E2）模拟增殖期，低E2/高P4条件（1 nM E2 + 100 nM P4）模拟分泌期。高E2条件较分泌期模拟条件显著增加节段数、连接点数（p < 0.05）、血管直径（p < 0.001）和体积分数（p < 0.01）。低E2/高P4条件较对照显著降低血管直径和体积分数（p < 0.001），并显著增加血管通透性（p < 0.001）。蛋白表达分析显示，高E2和低E2/高P4条件均高表达EGF、bFGF和IL-8，但VEGF检测极少或未检出。TIMP-2在高E2条件下表达略高。值得注意的是，尽管低E2/高P4条件结构特性降低且通透性增加，但其所有血管生成蛋白表达均高于低E2和对照条件。
（四）在子宫内膜血管模型中观察到EVT血管重塑潜力
研究人员将HTR8/SVneo和JEG-3细胞灌注至预组装的子宫内膜血管网络中培养1天和3天。HTR8/SVneo细胞分布于整个基质并与血管重叠，而JEG-3细胞则聚集于HEMEC周围。D3时JEG-3细胞显著增加血管通透性（p < 0.01），而HTR8/SVneo未引起显著变化。D1时HTR8/SVneo的整合程度为JEG-3的1.3倍（p < 0.05），但D3时两者无显著差异。TUNEL检测显示，D1时JEG-3条件具有最多TUNEL阳性核（39个），凋亡主要发生在JEG-3细胞小团块附近的HEMEC区域。D3时JEG-3完全包绕的区域未见凋亡，TUNEL表达下降1.8倍（p < 0.05）。总体而言，JEG-3诱导的TUNEL阳性核占总细胞3%。
四、讨论与结论
该研究开发了首个可灌注的人子宫内膜微血管模型，填补了SAR体外模型的空白。模型具有模块化特性，可整合多种细胞类型并实现细胞外基质组成和可溶性生化因子的时空变化。研究确定5:1的HEMEC:NHLF比例可显著改善网络互连性，这与成纤维细胞增殖速度快于内皮细胞、高比例成纤维细胞会空间限制内皮组装有关。VEGF+bFGF+S1P联合处理在提高血管密度的同时维持了固有结构-功能特性，形成的血管直径约15-30 μm，符合妊娠早期螺旋动脉特征。
激素研究揭示了E2和P4对子宫内膜血管化的差异性调控。高E2条件下检测到极低VEGF水平，但血管密度和网络连接性仍显著改善，提示存在VEGF非依赖性促血管生成通路，如IL-8和EGF的参与。IL-8已被证明可通过独立于VEGF配体相互作用的机制反式激活VEGFR-2。TIMP-2的高表达可能解释了高E2条件下通透性较低的现象。分泌期模拟条件表现出高度促血管生成的分子指纹但结构特性降低，提示P4可能诱导了与促血管生成信号竞争的抑血管生成级联反应。
EVT整合研究揭示了两种细胞系不同的重塑机制。HTR8/SVneo主要呈间充质表型，非特异性迁移至基质和血管中，引起有限的血管重塑。JEG-3细胞主要呈eEVT表型，以团块形式向内皮细胞迁移，D1时小量到达血管的JEG-3细胞引起最高程度的局部HEMEC凋亡。值得注意的是，D3时JEG-3高聚集区域显示大量HEMEC和基质重塑但无TUNEL表达，结合ECM基质的完全消化，提示JEG-3介导的大部分重塑可能通过机械性细胞脱离导致失巢凋亡（anoikis）而非直接细胞-细胞杀伤机制，也可能涉及胞啃作用（trogocytosis）。
研究也承认了局限性：NHLF可能无法准确模拟子宫内膜间质细胞的功能，未来可通过整合原代或永生化子宫内膜间质细胞来改进模型。该研究建立的模块化平台为理解PE及其他由子宫内膜血管化和SAR失调驱动的妊娠相关病理的机制奠定了基础。
