《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Tumor Treating Fields Enhance Temozolomide-Associated Growth Suppression in Glioblastoma Cells and Patient-Derived Organoids Through Cell-Cycle Blockade, Apoptosis, and SMAD-Associated Signaling
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目的：胶质母细胞瘤（GBM）尽管接受多模式治疗仍难以治愈。肿瘤治疗电场（TTF）可破坏有丝分裂并为GBM提供临床获益，但与TTF相关的分子反应以及TTF联合替莫唑胺（TMZ）的效果尚未完全阐明。
方法：在U251和SHG140 GBM细胞及患者源性类器官中评估
目的：胶质母细胞瘤（GBM）尽管接受多模式治疗仍难以治愈。肿瘤治疗电场（TTF）可破坏有丝分裂并为GBM提供临床获益，但与TTF相关的分子反应以及TTF联合替莫唑胺（TMZ）的效果尚未完全阐明。
方法：在U251和SHG140 GBM细胞及患者源性类器官中评估了TMZ、TTF及TMZ+TTF的作用。TTF以200 kHz和1.75 V/cm RMS施加。进行了活力、集落形成、迁移相关表型、凋亡、细胞周期分布、蛋白质印迹法、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、RNA测序（RNA-seq）以及类器官形态学/免疫荧光分析。使用SB525334评估SMAD相关信号传导。
结果：联合TMZ+TTF处理比任一单药治疗更强烈地抑制了细胞活力、克隆性生长和迁移相关表型，对类器官结构完整性产生了更大的破坏，并伴有裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）激活增加和凋亡群体增多。RNA-seq鉴定出TTF相关的转录组变化涉及染色质相关过程、DNA复制和细胞周期通路。TTF与特定的SMAD相关信号改变、G2/M期积累、检查点信号改变以及促凋亡信号增强相关。SB525334部分减弱了TTF相关的SMAD磷酸化、生长抑制和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3诱导。
结论：TTF在GBM细胞系和类器官中增强了TMZ相关的抗肿瘤反应，伴随细胞周期阻滞、凋亡相关变化及特定的SMAD相关信号应答。
研究背景与问题
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见且最具侵袭性的恶性肿瘤。尽管最大安全切除术后辅以放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗改善了患者预后，但肿瘤异质性、浸润性生长和早期化疗耐药性仍严重限制治疗效果。肿瘤治疗电场（TTF）是一种局部区域生物物理疗法，通过施加低强度、中频交变电场（1–3 V/cm，100–300 kHz）干扰微管动力学、有丝分裂纺锤体组装和收缩环形成，从而诱导染色体错误分离、有丝分裂停滞和细胞死亡。TTF已被批准用于复发和新诊断的GBM，随机研究显示将TTF纳入GBM治疗可带来生存获益。然而，TTF诱导的分子反应，特别是其与基于TMZ的治疗之间的关系，仍未完全明确。TMZ仍是GBM化疗的基石，但内在和获得性耐药常限制其疗效，而TTF单独使用提供的抗肿瘤活性也不完全。由于TMZ诱导DNA烷基化和复制应激，而TTF破坏有丝分裂进程和染色体分离，二者联用可能增强GBM生长抑制。此外，转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD通路在GBM生物学中具有上下文依赖性功能，既可抑制增殖并促进凋亡，也与上皮-间充质转化（EMT）样程序、免疫逃逸、干性和治疗抵抗相关。但TTF是否与SMAD相关信号改变有关，以及这些改变是否有助于凋亡和生长抑制尚不清楚。因此，本研究旨在探索TTF单独及联合TMZ在GBM细胞系和患者源性类器官（PDOs）中的作用，并通过转录组学和功能实验解析相关分子机制。
研究方法
研究人员采用CL-301A系统在200 kHz和1.75 V/cm RMS条件下施加TTF，选用U251和SHG140 GBM细胞系以及来自苏州大学附属第四医院手术标本的三例独立PDO系（均为世界卫生组织IV级、异柠檬酸脱氢酶野生型）。主要关键技术包括：细胞活力检测（CCK-8法和ATP发光法）、集落形成实验、迁移相关表型评估（Transwell小室和划痕愈合实验）、凋亡检测（裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3免疫荧光和膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶流式细胞术）、细胞周期分析（碘化丙啶染色流式细胞术）、蛋白质印迹法（检测p-SMAD2、p-SMAD3、总SMAD2、TGFβRI、BIM、PUMA、p-CHK1等蛋白）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR，分析TGFβR1、SMAD2、SMAD3 mRNA水平）、RNA测序（RNA-seq，仅对照组与TTF处理组U251细胞，三独立生物学重复）及富集分析（基因本体论、京都基因与基因组百科全书和Reactome数据库），并使用选择性ALK5/TGFβRI抑制剂SB525334进行机制验证。
研究结果
3.1 TTF参数验证及TMZ+TTF介导的GBM细胞生长与迁移相关表型抑制
在固定场强1.75 V/cm RMS下，200 kHz对两种细胞系产生稳定抑制效果，300 kHz未进一步增强；在固定频率200 kHz下，随场强增加活力逐渐降低，因此选定200 kHz和1.75 V/cm RMS。ATP发光法显示联合组在48和72小时ATP活性下降最显著；CCK-8法在72小时同样显示联合组活力低于任一单药。集落形成实验中，TMZ或TTF单药减少克隆性生长，联合组抑制最为明显。Transwell实验表明联合组迁移细胞数进一步减少，划痕愈合实验也支持这一趋势。
3.2 联合TMZ+TTF处理增强GBM细胞的凋亡反应
裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3免疫荧光显示，单药处理后荧光强度升高，联合组最强。膜联蛋白V-FITC/PI流式细胞术证实，单药增加凋亡群体并减少活细胞比例，联合组活细胞比例最低，且在48小时较24小时进一步降低，伴随膜联蛋白V阳性凋亡群体增加。
3.3 探索性RNA-seq鉴定U251 GBM细胞中TTF相关的转录组变化
RNA-seq共鉴定出4145个差异表达基因（2578个上调，1567个下调），上调基因包括热休克蛋白家族成员。富集分析表明TTF暴露与转录调控、染色质相关过程、DNA复制和细胞周期通路相关。
3.4 TTF与四个处理组中选定的SMAD相关信号改变相关
KEGG富集分析提示TGF-β/SMAD相关条目在TTF差异表达基因中富集。蛋白质印迹法显示TTF增加SMAD2和SMAD3磷酸化，TMZ单独作用有限，联合组磷酸化水平与TTF组相当。qRT-PCR显示TTF处理后TGFβR1和SMAD3 mRNA表达升高，SMAD2呈轻微上升趋势。
3.5 TGFβRI/ALK5抑制部分减弱TTF相关的SMAD磷酸化、生长抑制和凋亡反应
SB525334显著减弱TTF诱导的SMAD2/3磷酸化。CCK-8实验显示SB525334部分挽救TTF相关的活力丧失，但未完全恢复至对照水平。裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3免疫荧光表明SB525334降低TTF相关的裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活。
3.6 TTF与DNA复制和有丝分裂通路下调及G2/M期积累相关
转录组分析显示下调基因富集于DNA修复、复制起始、染色质相关有丝分裂、DNA链延伸和G1/S转换通路。流式细胞术证实TTF增加G2/M期细胞比例并减少S期比例。蛋白质印迹法显示TTF暴露后p-CHK1表达降低，BIM和PUMA表达升高。
3.7 联合TMZ+TTF处理增强GBM类器官的结构破坏和凋亡相关反应
三例独立PDO系中，对照类器官基本维持球形结构，TMZ处理出现细胞脱落和空泡，TTF处理显示渐进性结构紊乱，联合组在24小时即出现更明显的结构破坏，48小时结构完整性丧失更严重。以PDO系为统计单位的定量免疫荧光分析显示，TTF暴露类器官中裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3荧光升高、Ki-67荧光降低，联合组变化最大。
讨论与结论
本研究证明TTF抑制GBM细胞生长并增强TMZ相关的活力、克隆性生长和迁移相关表型降低，同时增加凋亡相关反应，支持TTF作为TMZ互补治疗方案的进一步评估。但研究未纳入TMZ耐药模型，也未进行正式相互作用分析（如Bliss、Loewe或Chou-Talalay建模），因此结果为增强的联合效应而非确切的协同作用。RNA-seq揭示了TTF相关的转录组变化，其中SMAD相关信号被进一步关注。TTF暴露增加SMAD2/3磷酸化，但该反应主要与TTF相关，TMZ未进一步增强。需谨慎解读SMAD信号在GBM中的作用，因其既可诱导细胞周期阻滞和凋亡，也与侵袭、免疫逃逸和耐药相关。SB525334部分减弱了TTF相关的生长抑制和凋亡诱导，提示SMAD信号可能参与但不完全解释TTF效应。此外，TTF还导致DNA复制和细胞周期进程改变、G2/M期积累以及检查点和凋亡信号变化。PDO模型支持体外发现，但缺乏体内验证和正常神经细胞对照。总体而言，TTF相关的生长抑制伴随DNA复制和细胞周期阻滞、G2/M期积累、凋亡相关反应及选定的SMAD信号改变。联合TMZ+TTF在GBM细胞系和PDO模型中产生更强的抗肿瘤效应，支持TTF作为TMZ互补治疗方案的进一步评估，但这些发现仍属临床前体外和离体证据。
研究结论翻译：本研究表明，TTF在GBM细胞系和患者源性类器官中增强TMZ相关的生长抑制和凋亡相关反应。这些效应伴随DNA复制和细胞周期阻滞、G2/M期积累、促凋亡信号以及选定的SMAD相关信号改变。TGFβRI/ALK5抑制的部分减弱提示SMAD相关信号可能参与但不完全解释TTF相关的生物学反应。总体而言，这些发现支持TTF作为增强TMZ相关抗肿瘤效应的互补治疗方案，而正式的药理相互作用仍有待确定。
