肝细胞HIF2α调控代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的肝外疾病相关表型

《Comprehensive Physiology》：Hepatic HIF2α Modulates Extra-Hepatic Disease-Associated Phenotypes During Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）影响着全球超过三分之一的成年人，显著增加了心血管疾病风险。此外，严重肝病患者会出现肌肉无力和疲劳。缺氧诱导因子2α（HIF2α）在MASLD患者的肝脏中积累。本研究旨在探讨肝HIF2α在介导MASLD肝脏及肝外表型中的作用。利用肥胖小鼠MASLD模型，研究人员研究了肝细胞特异性HIF2α敲除（hHIF2α?/?）对肝脏、心脏和骨骼肌代谢以及心脏功能的影响。在28周内，小鼠接受高脂、高果糖、高胆固醇（GAN）饮食，诱导了肥胖、肝脂肪变性、纤维化和炎症。hHIF2α?/?与更高的肝脏NADH支持的线粒体呼吸、更高的鞘磷脂水平以及对MASLD诱导的高胰岛素血症的保护作用相关，但对MASLD的肝脏表现并无保护作用。相反，在GAN喂养小鼠的心脏中，hHIF2α?/?导致二酰甘油和长链酰基肉碱积累，并加剧了饮食诱导的神经酰胺积累。来自hHIF2α?/?小鼠的Langendorff灌注心脏表现出收缩和舒张功能障碍，包括左心室发展压降低24%和最大松弛速率（dP/dtmin）降低34%。然而，从hHIF2α?/?小鼠分离的心脏通过自主受体激动剂刺激确定，受到保护免受MASLD相关的交感神经优势影响。GAN喂养和hHIF2α?/?均与较低的瘦体重相关（分别比各自对照组低14%和5.4%），而hHIF2α?/?增强了腓肠肌中氧化磷酸化（OXPHOS）相关蛋白水平。总体而言，hHIF2α?/?导致了有害的肝外效应，包括心肌脂质积累、心脏功能受损和全身瘦体重减少，从而恶化了MASLD相关病理特征的系统性表现。

一、研究背景与研究目的

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）影响全球约38%的成年人口，其患病率与肥胖流行密切相关，体重指数（BMI）和代谢异常如血脂异常及2型糖尿病是主要风险因素。MASLD是一个谱系性疾病，最初表现为相对良性的脂肪肝，随时间推移可进展为纤维化和更严重的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），后者以肝脏炎症、肝细胞气球样变和死亡以及纤维化为特征，最终可能导致肝硬化或肝细胞癌。目前仅有甲状腺激素受体-β激动剂resmetirom被专门批准用于MASLD治疗，凸显了对病理生理机制深入理解的迫切需求。

研究表明，MASLD患者肝脏中缺氧诱导因子2α（HIF2α）发生积累，该因子调节脂肪酸氧化（FAO）、从头脂肪生成及与疾病进展相关的过程。然而，在更接近人类病理学的肥胖模型中，HIF2α是否促进MASLD尚不清楚，且肝细胞特异性干预对整体病理学的影响也未知。重要的是，MASLD被视为多系统疾病，其主要死因为心血管疾病，包括心肌病，同时严重脂肪变性与肌少症相关，疲劳也是常见症状。因此，迫切需要理解连接各器官病理过程的机制。

本研究利用经过充分验证的肥胖小鼠MASLD模型，探究肝细胞特异性HIF2α敲除对肝脏病理和脂质代谢的影响，同时研究心脏功能和代谢，并通过测量身体成分和线粒体代谢考察骨骼肌的作用，最后将血浆脂质组作为肝脏与其他器官间串扰的潜在介质进行分析。

二、主要技术方法

1. 1.
   动物模型构建：采用C57Bl6/J背景的肝细胞特异性Epas1基因敲除小鼠（hHIF2α^?/?）及其野生型同窝对照，雄性小鼠自6-9周龄起分别给予标准实验室饲料或高脂高果糖高胆固醇GAN饮食共28周。
2. 2.
   组织学评估：使用苏木精-伊红（H&E）染色评估NASH活性评分（NAS），油红O（ORO）染色检测中性脂质，天狼星红（PSR）染色评估纤维化程度，免疫组化法进行骨骼肌纤维分型。
3. 3.
   心脏功能评估：采用Langendorff离体心脏灌流系统测定基础收缩和舒张功能参数，并通过β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素和毒蕈碱胆碱能受体激动剂卡巴胆碱刺激评估自主神经反应性。
4. 4.
   线粒体呼吸功能测定：使用高分辨率呼吸测定仪（Oxygraph-2k）在透化心肌纤维或肝脏匀浆中测定线粒体呼吸容量，同时在冻存骨骼肌样品中进行呼吸测定。
5. 5.
   脂质组学和酰基肉碱分析：采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）开放谱分析方法对肝脏、心脏和血浆进行脂质组学分析，并使用三重四极杆质谱进行酰基肉碱靶向分析。
6. 6.
   分子生物学分析：通过RT-qPCR检测肝脏和心脏中脂肪酸氧化、脂肪生成及鞘脂代谢相关基因的表达，使用Western blot检测骨骼肌氧化磷酸化复合物亚基蛋白水平。

三、研究结果

2.1 肝细胞特异性HIF2α缺失不能防止GAN诱导的MASLD

GAN喂养28周后，小鼠体重增加32%，脂肪量增加3.2倍，肝脏重量增加1.9倍，血浆丙氨酸转氨酶升高3.1倍，NASH活性评分升高6.7倍，油红O染色显示脂肪变性增加3.4倍，天狼星红染色显示纤维化增加3.3倍，纤维化标志物Col1a1和Serpine1表达分别升高30倍和6.3倍。然而，肝细胞HIF2α缺失对任何MASLD相关特征均无明显影响，尽管hHIF2α^?/?小鼠瘦体重较野生型低5.4%。

2.2 肝细胞特异性HIF2α缺失可预防高胰岛素血症但不能预防高血糖

GAN喂养导致空腹和进食状态血糖升高，野生型小鼠空腹血浆胰岛素升高4.9倍，进食胰岛素升高3.4倍，HOMA-IR升高5.4倍。hHIF2α^?/?小鼠虽未受保护免于高血糖，但GAN喂养的hHIF2α^?/?小鼠空腹胰岛素较GAN野生型低44%，进食胰岛素低42%，HOMA-IR仅升高2.4倍。

2.3 肝脏HIF2α缺失影响肝脏线粒体代谢和基因表达，但对肝脏脂质组影响有限

GAN喂养小鼠肝脏中FAO相关基因Cpt1a、Hadh和Pgc1a表达升高，hHIF2α^?/?小鼠Cpt1a表达进一步升高38%。高分辨率呼吸测定显示，hHIF2α^?/?小鼠NADH链接的呼吸容量较野生型高31%。肝脏脂质组分析显示，两个鞘磷脂物种SM 41:1和SM 42:2在hHIF2α^?/?小鼠中分别高34%和14%，且Cer合成酶Cers6表达在hHIF2α^?/?小鼠中高58%。

2.4 肝细胞HIF2α缺失与基础心脏功能障碍相关但可预防GAN诱导的交感神经优势

Langendorff灌流实验显示，hHIF2α^?/?小鼠左心室发展压（LVDP）降低24%，最大收缩速率（dP/dt_max）降低32%，最大舒张速率（dP/dt_min）降低34%。然而，在GAN喂养背景下，hHIF2α^?/?小鼠心脏的变时性和变力性交感神经优势比率分别较GAN野生型低3.3倍和5.4倍，表明受保护免于交感神经优势。

2.5 肝细胞HIF2α缺失与心脏中推定脂毒性及信号脂质的积累相关

GAN喂养小鼠心脏中性脂质积累增加7.2倍，甘油三酯升高38%。hHIF2α^?/?小鼠心脏中二酰甘油（DAG）水平高13%，溶血磷脂酰胆碱（LPC）高21%，且在GAN喂养背景下神经酰胺水平进一步升高25%。CPT1b表达在hHIF2α^?/?小鼠心脏中低14%，GAN喂养的hHIF2α^?/?小鼠长链酰基肉碱相对水平升高3.1倍。

2.6 缺乏肝脏HIF2α的小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达发生变化

hHIF2α^?/?小鼠腓肠肌中线粒体复合物I亚基蛋白水平高1.8倍，复合物II亚基高2倍。GAN喂养小鼠比目鱼肌中快氧化型IIa纤维比例增加，快酵解型IIx纤维比例降低。

2.7 血浆脂质组受GAN喂养影响但不受肝细胞HIF2α缺失影响

GAN喂养导致血浆甘油三酯降低64%，胆固醇酯升高91%，胆固醇升高2.6倍，鞘磷脂升高23%，LPC升高34%，PC升高39%。主成分分析显示按饮食而非基因型分离，未发现任何脂质类别受肝细胞HIF2α缺失影响。

四、讨论与结论

本研究发现，在肥胖小鼠MASLD模型中，肝细胞特异性HIF2α缺失并未对肝脏病理产生保护作用，这与先前在胆碱缺乏瘦小鼠模型中的观察结果不同。研究人员认为，更长时间的膳食挑战以及额外添加高果糖和高胆固醇可能压倒了HIF2α缺失的保护效应。尽管hHIF2α^?/?小鼠肝脏NADH链接呼吸增强，但这不足以影响MASLD严重程度。

相反，研究揭示了肝细胞HIF2α缺失导致的负面肝外效应，包括心脏收缩和舒张功能障碍，这可能与心肌中二酰甘油、溶血磷脂酰胆碱和神经酰胺等推定脂毒性和信号脂质的积累有关。值得注意的是，虽然基础心功能受损，但这些小鼠却受到保护免于GAN饮食诱导的心脏交感神经优势，同时高胰岛素血症也得到缓解。

在骨骼肌方面，hHIF2α^?/?小鼠瘦体重较低，但腓肠肌线粒体蛋白水平升高，可能是对较低瘦体重的代偿反应。两种鞘磷脂SM 41:1和SM 42:2在hHIF2α^?/?小鼠肝脏和心脏中均升高，提示肝-心脂质代谢间可能存在串扰。

研究结论：在与人疾病高度相关的肥胖小鼠MASLD模型中，肝细胞特异性HIF2α缺失调节了肝脏线粒体和脂质代谢，但未能保护免受MASLD。这些发现与在瘦小鼠肝病模型和短期高脂喂养中观察到的保护效应不同，表明在长期饮食应激下该干预措施对疾病进展的影响更为有限。相反，研究人员提出MASLD期间肝脏HIF2α激活起到保护作用，抵御一系列不良系统性效应，包括较低的瘦体重、心脏脂毒性脂质积累以及心脏收缩和舒张功能障碍，尽管缺失确实阻止了GAN诱导的高胰岛素血症和心脏交感神经优势，这可能在某些疾病情境下提供保护。总体而言，这些发现将肝脏氧感知与肝外脂质代谢和器官功能联系起来，强调了MASLD的系统性本质，支持继续追求肝脏靶向代谢干预的同时，重申了在MASLD本身及其治疗背景下考虑系统性生理学的重要性。