《Cancer Reports》：Exploratory Analysis of Circulating miR-486-3p and miR-21-5p in Early Detection and Subtype Classification of Luminal A and B Breast Cancer in Peruvian Women
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摘要
背景：乳腺癌（breast cancer，BC）仍是全球女性中最常见的恶性肿瘤，早期检测对改善临床结局至关重要。目前亟需可及性高、微创的分子标志物，以补充现有诊断方法并支持分子分型。
目的：这项探索性病例对照研究评估了秘鲁女性Luminal A（n=32
摘要
背景：乳腺癌（breast cancer，BC）仍是全球女性中最常见的恶性肿瘤，早期检测对改善临床结局至关重要。目前亟需可及性高、微创的分子标志物，以补充现有诊断方法并支持分子分型。
目的：这项探索性病例对照研究评估了秘鲁女性Luminal A（n=32）与Luminal B（n=43）乳腺癌患者及健康对照（n=36）血浆中四种循环miRNA（miR-21-5p、miR-486-3p、miR-451a和miR-660-5p）的表达水平。
方法与结果：采用qPCR定量表达水平，并通过留一交叉验证（leave-one-out cross-validation，LOOCV）的逻辑回归评估诊断性能。miR-486-3p在Luminal A中较对照组和Luminal B均显著上调，而miR-21-5p相对对照组下调。验证后，miR-486-3p区分Luminal A与对照组保留中等判别能力（AUC=0.651；95% CI：0.461–0.841；p=0.120），而miR-486-3p/miR-21-5p联合模型区分Luminal A与Luminal B表现出中等判别性能（AUC=0.690；95% CI：0.466–0.914；p=0.0959）。探索性功能富集分析提示，这些miRNA经实验验证的靶基因与癌症及免疫相关通路有关，为其在乳腺癌中的潜在作用提供了生物学背景。
结论：这些发现为循环miR-486-3p和miR-21-5p作为未来Luminal型乳腺癌早期检测及分子分型的候选非侵入性生物标志物提供了初步证据。然而，这些结果应谨慎解读，并需在更大规模的独立队列中验证后方可进入临床应用。
论文解读：循环miR-486-3p与miR-21-5p在Luminal型乳腺癌早期检测与分子分型中的探索性研究
一、研究背景与问题
乳腺癌是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。在秘鲁，乳腺癌同样是女性最常见的癌症，2021年死亡率为每10万居民11.0例，部分原因归咎于诊断较晚。尽管钼靶筛查在早期诊断中发挥核心作用，但其在年轻女性和致密型乳腺组织女性中敏感性降低，且在许多拉丁美洲国家，由于社会经济和地理障碍，筛查覆盖率仍不理想。这些局限凸显了对补充性循环分子标志物的需求，以期改善早期非侵入性诊断和分子分型。乳腺癌包含多种分子亚型，其中Luminal A和Luminal B是最常见的激素受体阳性类型。Luminal A肿瘤通常增殖率较低、雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达较高，而Luminal B肿瘤Ki-67水平较高，可能共表达HER2，预后较差。鉴于亚型间预后和治疗反应的差异，miRNA已成为肿瘤学中颇具前景的非侵入性生物标志物。既往研究主要比较患者与健康对照以评估循环miRNA的检测价值，但专门探讨其区分Luminal A与Luminal B亚型能力的研究相对较少；且证据多来自非拉丁美洲人群，聚焦早期疾病并结合内部验证诊断模型的研究更少。因此，循环miRNA用于分子亚型区分的临床价值仍未充分阐明。
二、研究内容与结论
研究人员开展了一项观察性病例对照研究，纳入36名无乳腺癌家族史的健康对照、32名早期（I–II期）Luminal A患者和43名早期Luminal B患者，所有病例均在治疗前于秘鲁利马国立肿瘤疾病研究所（National Institute of Neoplastic Diseases，INEN）招募。研究评估了四种循环miRNA（miR-21-5p、miR-486-3p、miR-451a和miR-660-5p）在血浆中的表达水平及其诊断性能。结果显示，miR-486-3p在Luminal A中较对照组和Luminal B均显著上调，而miR-21-5p在Luminal A中相对对照组显著下调（7.4倍下降）。miR-451a和miR-660-5p在各组间无显著差异。经LOOCV验证后，miR-486-3p区分Luminal A与对照组保留中等判别能力（AUC=0.651），miR-486-3p/miR-21-5p联合模型区分Luminal A与Luminal B的AUC为0.690。将Ki-67加入miRNA模型后AUC从0.690提升至0.785，但未超过单独Ki-67的判别能力（AUC=0.855）。功能富集分析提示miR-21-5p靶基因富集于癌症和免疫相关通路，miR-486-5p靶基因富集于Fc gamma受体介导的吞噬作用和C型凝集素受体信号通路。该研究是首批在秘鲁队列中同时评估这四种循环miRNA用于Luminal型乳腺癌早期检测和分子亚型区分的研究之一，为循环miR-486-3p和miR-21-5p作为候选非侵入性生物标志物提供了初步证据，但需在更大独立队列中验证。
三、主要技术方法
研究人员采用病例对照研究设计，样本来源于秘鲁INEN，包括36名对照、32名Luminal A和43名Luminal B早期乳腺癌患者。外周血经两次离心分离血浆并冻存。使用Norgen Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit提取总RNA，经poly(A)加尾和逆转录合成cDNA，采用miRNA特异性qPCR定量表达，以RNU6为内参基因，2?ΔΔCt法计算相对表达量。统计分析使用R 4.4.1，组间比较采用ANOVA或Kruskal-Wallis检验及Bonferroni校正的事后检验，相关性分析采用Spearman相关，诊断性能通过逻辑回归结合留一交叉验证（LOOCV）评估，ROC曲线和AUC采用pROC包计算。靶基因预测使用multiMiR包获取实验验证的靶基因，KEGG通路富集分析采用clusterProfiler包。
四、研究结果
3.1 研究人群的人体测量学特征：共111名女性分为对照组（n=36）、Luminal A（n=32）和Luminal B（n=43）。除乳腺癌家族史在三组间差异显著（p=1.042e?07）外，其余人体测量和妇科变量均无显著差异。
3.2 miR-486-3p和miR-21-5p在各组间的差异表达：通过Dunn检验（Bonferroni校正）比较各组miRNA表达。miR-21-5p在Luminal A中较对照组显著下调（7.4倍下降，p=0.0104）。miR-486-3p在Luminal A中较对照组（p=0.0166）和Luminal B（p=0.00195）均显著上调。miR-451a和miR-660-5p在各组间无显著差异。miR-451a作为溶血标志物，其稳定表达提示溶血对结果影响极小。
3.3 miRNA表达相关性分析：通过Spearman相关分析发现，miR-451a与miR-21-5p在Luminal A和对照组间呈强正相关（ρ=0.82，p<0.05），提示可能存在共调控。此外，miR-21-5p在对照组中与体重呈正相关（ρ=0.53，p<0.01）。
3.4 ROC曲线与AUC评估：仅对miR-21-5p和miR-486-3p进行ROC分析。经LOOCV验证后，miR-486-3p区分Luminal A与对照组的AUC=0.651（95% CI：0.461–0.841，p=0.120）；miR-21-5p和miR-486-3p联合模型区分Luminal B与对照组的AUC=0.635（95% CI：0.460–0.810，p=0.132）；区分Luminal A与Luminal B的AUC=0.690（95% CI：0.466–0.914，p=0.0959）。将Ki-67加入miRNA模型后AUC提升至0.785（p=0.0128），但未超过单独Ki-67（AUC=0.855），三标志物模型与经典临床指标组合（ER、PR、HER2、Ki-67，AUC=0.750）性能相当。
3.5 miRNA靶基因功能富集：通过multiMiR获取实验验证的靶基因，miR-21-5p有135个、miR-486-5p有6个，两者无共享靶基因。KEGG富集分析显示miR-21-5p靶基因富集于20条通路，主要包括癌症中的miRNA、MAPK信号通路、TNF信号通路、癌症中的蛋白聚糖、AGE-RAGE信号通路和铂类药物耐药等；miR-486-5p靶基因仅富集于Fc gamma受体介导的吞噬作用和C型凝集素受体信号通路两条免疫相关通路。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，miR-486-3p在Luminal A中较对照组和Luminal B均上调，与Arabkari等人的报道一致，支持其作为区分Luminal A的潜在分类标志物，但其初始判别性能在LOOCV验证后统计学显著性丧失，提示可能存在过拟合或样本特异性变异。miR-21-5p在本队列中呈下调，与多数文献报道的上调模式相反，可能反映早期Luminal A肿瘤的分子特征或雌激素受体阳性肿瘤中雌二醇对miR-21-5p的抑制作用，强调区域验证的必要性。miR-451a和miR-660-5p无显著差异，miR-451a的稳定表达提示溶血控制良好。miR-451a与miR-21-5p的强正相关提示可能通过Wnt/β-catenin通路共调控。功能富集分析为两种miRNA在增殖和免疫相关过程中的潜在参与提供了生物学背景，但属于假设生成性质。研究的主要局限是样本量有限、缺乏前瞻性溶血对照和no-RT对照。
研究结论：循环miR-486-3p和miR-21-5p显示出作为早期Luminal型乳腺癌候选生物标志物的初步潜力。miR-21-5p主要有助于区分Luminal A与健康对照，miR-486-3p在分子亚型区分方面也显示出潜力。将这些循环生物标志物与常规临床病理标志物整合，可能支持未来微创的早期检测和亚型分类策略。然而，在临床实施前需在更大规模的独立队列中验证。
