CRISPR/Cas9 在斜纹夜蛾中解析杀虫剂抗性的应用：全面综述

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：CRISPR/Cas9 applications in Spodoptera exigua for understanding insecticide resistance: A comprehensive review

摘要

本综述全面审视了当前对斜纹夜蛾（Spodoptera exigua）杀虫剂抗性的认知，并评估了基因编辑技术在抗性相关基因功能鉴定方面的最新进展。具体而言，它整合了当前关于抗性机制的知识，突出了成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）作为功能验证工具的应用，并明确了可持续害虫管理领域的未来研究方向。斜纹夜蛾是一种高度破坏性的世界性农业害虫，在全球多样的农业生态系统中造成了严重的作物减产。其广泛的寄主范围、强大的迁飞能力和高繁殖潜力促进了其快速全球扩散和频繁暴发。对化学杀虫剂的过度依赖导致了抗性的广泛产生，严重削弱了传统害虫管理策略的长期有效性。以往的综述主要总结了斜纹夜蛾中与抗性相关的基因和表型（如Hilliou等，2021年），而更广泛的CRISPR/Cas9综述则聚焦于多种昆虫类群，而未提供物种特异性的机制整合（如Xu等，2025年）。本文在四大主要抗性机制——靶标位点抗性、代谢解毒、转运体介导抗性和调控适应性方面，将零散证据整合为一个连接抗性生物学与基于CRISPR/Cas9的功能验证的统一框架。通过整合抗性机制与新兴的基因编辑方法，本综述为抗性监测、功能基因组学以及制定针对斜纹夜蛾种群更精准和可持续的管理策略提供了新的见解。

引言

植食性害虫因全球范围内产量大量损失而日益威胁全球农业生产力和粮食安全。据估计，病虫害使年作物产量减少20%至40%（Singh等，2022年），导致每年损失1000亿至4700多亿美元（Ahmad，2023年；Ju等，2021年；Kamatham等，2021年）。这些损失的社会经济影响十分严重，加剧了社会经济不稳定和粮食不安全，尤其是在易受影响的地区（Singh等，2022年）。过去的害虫防控主要依赖合成化学农药，因为交配干扰或不育昆虫技术等替代性综合害虫管理（IPM）策略通常无法有效应对高密度种群（Ju等，2021年）。这种依赖导致在持续选择压力下抗性迅速产生（Basavakiran Kumar等，2025年；Dai等，2023年）。一些最具破坏性的农业害虫属于夜蛾属（Spodoptera），它们是多食性、迁飞性且具有高繁殖潜力的（Hilliou等，2021年）。

斜纹夜蛾，又称甲虫夜蛾，是多样农业生态系统中限制农业生产的重要因素。据Hafeez等（2022年）报道，该物种已成为经济影响最大的害虫之一，影响了大量作物。它原产于东南亚地区（Song等，2025年）。该物种现已广泛分布于亚洲、非洲、欧洲、美洲和澳大利亚的热带和温带地区（Zheng等，2011年）。其广阔的迁飞范围和生态可塑性使其成为新栖息地的快速入侵者，如图1所示，进一步确认了其作为世界性害虫且具有重大经济影响的地位（Fu等，2017年）。田间观察表明，斜纹夜蛾的迁飞距离可达3500公里（Song等，2025年），这促进了新入侵地区种群的突然暴发。

斜纹夜蛾最显著的特征之一是其异常的高寄主可塑性。据报道，它危害超过130至170种植物，涵盖至少30至35个不同科（Dai等，2023年；Simon等，2021年），如图1所总结。其寄主范围广泛，包括玉米和水稻等主要粮食作物、棉花等纤维作物、大豆和豌豆等豆类作物，以及卷心菜、番茄、甜椒、花椰菜和甜菜等众多蔬菜作物（Ahmad，2023年；Dai等，2023年；Hafeez等，2022年；You等，2025年）。此外，Song等（2024年）指出，这种广泛的多食性使其在亚热带地区全年存活，并增加了大暴发的可能性。在中国，密集的大规模蔬菜种植为斜纹夜蛾提供了充足的食物来源和越冬场所（Zou等，2025a），导致多个省份发生灾害性暴发（Zhang等，2025年）。严重危害时产量损失可达75%，凸显了该物种的经济代价（Ahmad，2023年）。

数十年来，斜纹夜蛾一直是主要的防治难题，化学杀虫剂一直是控制该物种所致损害的主要手段，使其成为研究抗性进化和开发分子管理策略的重要模式生物（图2；图3）。然而，对这些化合物的重度依赖加剧了对各类化学杀虫剂抗性的产生（Dai等，2023年；Hafeez等，2019年；You等，2025年）。已报道了对有机磷类、氨基甲酸酯类、鱼尼精类、阿维菌素类、双酰胺类以及苏云金芽孢杆菌（Bt）毒素的抗性（Ahmad和Arif，2010年；Che等，2013年；Huang等，2021年；Ishtiaq等，2012年；Zuo等，2025年）。根据节肢动物农药抗性数据库（APRD），斜纹夜蛾报告的农药抗性案例数量居前列，反映出其高度的适应性潜力。

抗性发展的速度和程度令人担忧。在某些地区，经过数年的使用后，对双酰胺类的敏感性显著下降，抗性倍率超过2500至20,000倍，甚至频繁使用后达到10,000倍（Cho等，2018年）。另一个问题是同一化学类别内的交叉抗性，如图3所示，这意味着接触一种活性成分可能使其对类似化合物产生不敏感性（Kim等，2021年）。综合抗性管理（IRM）策略收效有限，很大程度上是由于持续的选择压力所致（Richardson等，2020年；Zuo等，2017年）。这些数据和趋势表明，亟需阐明使抗性得以进化的潜在分子机制。

有必要对候选基因进行准确的功能验证，以阐明抗性机制。传统的RNA干扰（RNAi）和经典遗传学方法已取得一定成果，但在鳞翅目昆虫中仍存在局限（Kumari等，2024年；Simon等，2021年；Singh等，2022年）。RNAi的特点是非规律且短暂的基因沉默，因为双链RNA会被降解且递送困难，因此无法建立确定的因果关系（Kim等，2017年；Zheng等，2024年）。经典定位和育种方法非常耗时且受遗传变异限制（Singh等，2022年）。图2展示了2000至2026年间与斜纹夜蛾基因编辑和杀虫剂抗性相关的研究格局和发表趋势。

CRISPR/Cas9基因编辑系统是一个精确（Guo等，2019年）且高效的基因改造平台（Wang等，2025b）。该技术利用单导向RNA（sgRNA）引导Cas9核酸酶在DNA特定位点进行位点特异性切割，从而产生稳定且可遗传的突变，可用于直接测试基因型与表型之间的关系（Zhu等，2020年）。CRISPR研究已在斜纹夜蛾中验证了ryanodine受体突变的功能作用（Zuo等，2017年），以及烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的功能（Wang等，2023年；Zuo等，2020年）。此外，利用基于CRISPR的方法还研究了ABC转运体（Huang等，2020a；Zuo等，2018年）和CYP9A家族成员（Shi等，2023年）等解毒相关基因的贡献。因此，CRISPR/Cas9提供了一个关键的框架，可通过利用高精度的基因组操作和功能验证来进一步推动抗性研究，从而为害虫管理的可持续方法提供依据。

斜纹夜蛾多重杀虫剂抗性的快速加剧，加上传统功能验证方法的局限性，凸显了全面综合CRISPR/Cas9在抗性研究中应用的迫切需求。尽管越来越多的文献已鉴定出关键机制，包括靶标位点突变、代谢解毒和转运体介导抗性，但这些发现仍然分散且缺乏一个将基于CRISPR的功能基因组学与抗性生物学整合的连贯框架。本综述通过提供关于斜纹夜蛾杀虫剂抗性的系统性机制见解来弥补这一空白，特别聚焦于CRISPR/Cas9技术在解析靶标位点、代谢、转运体介导和调控通路的功能作用方面的应用。此外，我们强调了新兴的基因编辑创新，包括多重编辑策略，并讨论其在推进可持续抗性管理和指导下一代害虫控制方法方面的潜力。

**片段：靶标位点与代谢抗性**

斜纹夜蛾具有发生靶标位点抗性的能力，其神经系统关键蛋白，特别是电压门控钠通道（VGSCs）和乙酰胆碱酯酶（AChE），会发生遗传改变（Liu等，2024年），如表1所总结。其不同地区的种群已对拟除虫菊酯类λ-氰氯对产生高抗性（Tian等，2018年），而一个加州田间品系被发现对灭多威的敏感性比敏感幼虫低30倍，这是由于在昆虫研究中使用的CRISPR/Cas9系统所揭示的。

**靶标位点抗性基因的功能验证**

CRISPR/Cas9已在斜纹夜蛾中功能确认了一组虽小但不断扩展的靶标位点抗性基因，使该领域从基于相关性的田间调查推进到直接的因果证明。目前有三例具有坚实的实验支持。首先，敲除nAChR α6亚基产生了对鱼尼精类的高度抗性，确立了该亚基作为此类杀虫剂在斜纹夜蛾中的主要功能靶标（Zuo等，2020a）。在此基础上，通过HDR介导的引入……

**细胞色素P450基因敲除**

斜纹夜蛾代谢抗性进化的一大标志是P450特定亚家族的大量扩增，由于基因组冗余性，这构成了极大的功能验证挑战。例如，在斜纹夜蛾中，CYP9A基因簇已扩展至12个基因，其中大部分对多种外源物的诱导表现出不同的模式（图4）（Hilliou等，2021年）。虽然一些基因，包括CYP321A8，已被证明是对氯和拟除虫菊酯类的主要抗性原因……

**ABC转运体与Bt抗性**

通过CRISPR/Cas9介导的解析，ABC转运体（ABC transporters）研究已确立SeABCC2作为斜纹夜蛾对Cry1Ac和Cry1Fa毒素不可或缺的、高效的受体。遗传验证表明，单独敲除SeABCC2即可赋予对Cry1Ac前毒素高达1180倍的抗性（Jin等，2026年）。相反，同源基因SeABCC3的破坏仅导致毒素敏感性发生不显著的改变，抗性倍率<2倍（Huang等，……

**超越敲除的新兴CRISPR应用**

HDR常被用于在斜纹夜蛾中进行精确修饰，以ssODN为模板（Zuo等，2017年）。最早的研究之一利用CRISPR/Cas9介导的HDR在敏感背景中引入与田间调查中双酰胺抗性相关的RyR G4946E替换（Zuo等，2017年）；对氯虫酰胺的抗性增加了223倍，表明该突变是因果关系且独立于全局代谢因素（Zuo等，2017年）。精确编辑也已……

**生物安全性、考量与展望**

脱靶特异性仍是CRISPR/Cas9应用的主要技术关切之一，详见第3.3节的详细讨论。除了已描述的sgRNA设计和遗传连锁验证步骤外，CRISPR工程昆虫的生物安全性评估还必须考虑生态风险，特别是对于携带可自我传递基因驱动的昆虫。CRISPR工程昆虫，特别是携带可自我传递基因驱动的昆虫，由于……极其危险。

**结论**

斜纹夜蛾的持续扩张和适应能力凸显了深入理解杀虫剂抗性机制的迫切需要。证据表明，该害虫的抗性是由靶标位点修饰、代谢解毒、转运体活性和调控变化等复杂相互作用所驱动的。

功能基因组学的进展，特别是CRISPR/Cas9的应用，为实验验证抗性基因和解析……提供了前所未有的机遇

**CRediT作者贡献声明**

Yasmin Junejo：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、软件、概念设计。Danish Ali：撰写——审阅与编辑、软件。Madan Lal Kolhi：撰写——审阅与编辑、软件。Fareed Uddin Memon：撰写——审阅与编辑、形式化分析。Haiyan Yu：撰写——审阅与编辑。Huzaifa Tariq：撰写——审阅与编辑。Zia Ullah Ashraf：撰写——审阅与编辑。Xiaohe Liu：撰写——审阅与编辑。Yongdong Wang：撰写——审阅与编辑。

**资金**

本研究由国家作物抗逆与高产重点实验室开放研究项目（SKLCSRHPKF2025019）和国家农业农村部黄土高原作物虫害综合防治重点实验室开放基金项目（KFJJ20230104）资助。

**未引用参考文献**

Boaventura et al., 2020
Cong et al., 2013
Fu et al., 2017
Gassmann et al., 2009
Hitz et al., 2018
Kinyanjui et al., 2025
Piatek et al., 2015
Samantsidis et al., 2019
Samantsidis et al., 2020
Sivakumar et al., 2007
Wu et al., 2018
Zhang et al., 2024
Zhou et al., 2025
Zhu et al., 2021

**利益冲突声明**

作者声明，他们没有任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争财务利益或个人关系。

**致谢**

第一作者衷心感谢新疆生产建设兵团政府奖学金研究 fellowship 的支持，该奖学金对她的学习、发展及本工作的完成作出了贡献。同时也特别感谢塔里木大学。此外，所有作者感谢Biorender（www.biorender.com）和Vosviewer（www.vosviewer.com）在图表绘制方面提供的帮助。

**作者信息**

Yasmin Junejo | Danish Ali | Madan Lal Kolhi | Fareed Uddin Memon | Haiyan Yu | Huzaifa Tariq | Zia Ullah Ashraf | Xiaohe Liu | Yongdong Wang | Haibing Xiao

塔里木大学农学院，阿拉尔 843300，中国