ZNF865（BLST）作为背痛中DNA损伤与细胞衰老的新型调控因子

《Aging Cell》：ZNF865 (BLST) a Novel Regulator of DNA Damage and Cell Senescence in Back Pain

　　

细胞衰老已被证明促进包括退行性椎间盘疾病（degenerative disc disease, DDD）在内的衰老相关疾病进展。然而，椎间盘（intervertebral disc, IVD）及其他组织/疾病中调控衰老的机制仍知之甚少。最近，ZNF865（BLST）被鉴定为一种此前未表征的锌指蛋白（zinc finger protein, ZNF），可调控与蛋白质加工、细胞衰老和DNA损伤修复相关的广泛基因。在此，研究人员表明ZNF865表达在人类和小鼠IVD样本中随年龄和病理而降低。利用CRISPR引导的基因调控，研究人员表明ZNF865是健康细胞功能所必需，并且是调节IVD细胞衰老和DNA损伤的关键蛋白，对多种组织和器官具有潜在意义。研究人员还证明，ZNF865下调可在无症状人髓核（nucleus pulposus, NP）细胞中诱导衰老。相反，在退行性NP细胞中恢复ZNF865可减轻衰老、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）表达和DNA损伤，增强细胞外基质（extracellular matrix, ECM）合成代谢，并将染色质可及性和基因表达恢复至健康状态。在体内，ZNF865的CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）可诱导椎间盘退变和疼痛行为。总之，这些发现确立ZNF865为基因组稳定性的新型调控因子，并作为介导衰老相关疾病中衰老/DNA损伤的潜在治疗靶点。

研究背景：细胞衰老被认为是衰老相关疾病进展的基础驱动因素。衰老细胞发生稳定细胞周期停滞，并分泌多种促炎和分解代谢因子，即衰老相关分泌表型（SASP），破坏组织微环境并维持炎症。在中枢神经系统、肺、骨关节和椎间盘等组织中，衰老细胞积累与疾病进展相关。背痛是最常见肌骨疾病之一，40%的背痛归因于DDD。DDD传统上与遗传、衰老、载荷史和代谢物运输不足有关，但随着DDD进展，细胞衰老增加、SASP相关因子和疼痛相关生长因子增多，导致ECM改变、机械不稳定和疼痛。靶向衰老细胞在IVD中已显示一定前景，但背痛中衰老的分子机制仍有限。ZNF865（BLST）此前功能未知，被鉴定为C2H2锌指蛋白，含1059个氨基酸、20个独特ZNF结构域、2个转录激活结构域（TAD）和2个TGEKP连接区，广泛表达；其罕见病突变影响多组织器官，且RNA测序数据将其与DNA损伤和衰老联系起来。因此，研究人员在人类背痛患者样本和多种啮齿动物模型中研究ZNF865在背痛中的作用。

研究人员开展了ZNF865在DDD/背痛中的首次功能表征，发现ZNF865表达随年龄和病理下降，与DNA损伤和细胞衰老增加相关；CRISPRa上调ZNF865可改善退行性NP细胞表型，CRISPRi下调则诱导衰老、DNA损伤和SASP，并在大鼠体内诱导椎间盘退变和疼痛行为。该研究提示ZNF865是维持基因组稳定性的关键调控因子和潜在治疗靶点。

主要关键技术方法：研究人员采用CRISPR激活（CRISPRa；dCas9-VPR）和CRISPR干扰（CRISPRi；dCas9-KRAB）调控ZNF865表达；使用RNA测序（RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和ATAC测序（ATAC-seq）分析转录组与染色质可及性；采用qRT-PCR、免疫荧光、SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、p16^INK4A和p21^waf1/Cip1染色、碱性彗星实验、Luminex和3D pellet培养。样本来源包括人无症状NP细胞（hNPCs，创伤患者）和退行性NP细胞（dhNPCs，背痛手术患者），Jacobsen et al.的4、12、24月龄小鼠尾椎IVD单细胞数据，以及Sprague Dawley大鼠。体内实验采用L4-L5和L5-L6 IVD注射，并进行von Frey、Hargreaves、组织学、椎间盘高度和退变评分分析。

结果：
2.1 ZNF865 Upregulation Alters Related Cell Functions Across Multiple Cell Types。研究人员用CRISPRa在HEK293细胞、脂肪来源干细胞（ASCs）和dhNPCs中上调ZNF865，RNA-seq分别发现2699、6647和1752个显著差异表达基因。KEGG 2021 Human Pathway分析显示，三种细胞共享细胞周期、DNA复制、细胞衰老、错配修复、p53信号、mTOR信号、碱基切除修复和同源重组等通路，提示ZNF865调控细胞分裂、DNA修复和衰老。

2.2 ZNF865 Expression Is Correlated With Human Degenerative Disc Disease and Aging。通过qRT-PCR和免疫荧光，研究人员发现hNPCs中ZNF865表达与年龄强相关（R²=0.95，p=0.0054），dhNPCs在匹配年龄下表达显著降低；ZNF865定位于细胞核。小鼠尾椎NP中ZFP865表达随4、12、24月龄增加而下降，表达细胞比例与年龄强负相关（r=?0.9976，p=0.04435）。dhNPCs中β-半乳糖苷酶染色和彗星尾DNA损伤均高于hNPCs，显示ZNF865表达与DDD、衰老和DNA损伤相关。

2.3 ZNF865 Downregulation in Asymptomatic Human NP Cells Induces Senescence and DNA Damage。研究人员在hNPCs中用CRISPRi（ZNF865-KRAB）下调ZNF865，发现细胞增殖能力下降，SA-β-gal、p16^INK4A和p21^waf1/Cip1染色分别增加5.4倍、4.7倍和6.9倍，碱性彗星实验显示DNA损伤显著增加，说明ZNF865下调足以诱导健康NP细胞衰老和DNA损伤。

2.4 ZNF865 Upregulation in Degenerative Human NP Cells Decreases Senescence, SASP Phenotype and DNA Damage。在dhNPCs中用CRISPRa上调ZNF865（ZNF865-VPR），细胞增殖增加，倍增时间由4.09天降至2.49天，接近hNPCs的3.2天；β-gal、p16^INK4A和p21^waf1/Cip1染色降低，DNA损伤降至接近无症状水平。Luminex显示10种SASP相关蛋白中9种显著下降，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MMP-1、MMP3、MMP-12、NGF-β和VEGF-a，MCP-1呈下降趋势；SASP评分接近hNPCs。3D pellet培养中胶原产生增加，GAG无显著增加，合成代谢评分升高，且SASP评分与合成代谢评分明显分离，表明ZNF865上调降低炎症并增强ECM沉积能力。

2.5 ZNF865 Overexpression Significantly Restores Chromatin Accessibility Toward a Healthy-Like State。ATAC-seq显示，hNPCs与dhNPCs之间有1163个差异染色质可及性位点，关联1705个基因，富集45条通路，包括糖胺聚糖合成、MAPK信号和细胞衰老。dhNPCs中上调ZNF865后，与dhNPCs相比有575个差异位点和4条富集通路；而ZNF865-VPR dhNPCs与hNPCs相比仅70个差异位点，减少94%，无通路富集。PCA显示ZNF865-VPR dhNPCs向hNPCs靠近，RNA-seq也显示类似基因表达转变。超几何检验显示RNA-seq与ATAC-seq基因重叠显著；COL6A2在hNPCs和ZNF865-VPR dhNPCs中上调，USP12下调，且与染色质可及性变化一致，表明ZNF865上调推动dhNPCs向健康分子表型转变。

2.6 CRISPRi of ZNF865 Induces DDD and Painful Outcomes In Vivo。研究人员验证大鼠ZNF865直系同源基因后，在Sprague Dawley大鼠NP细胞中CRISPRi下调ZNF865，发现增殖下降，SA-β-gal和p16增加，DNA损伤增加，MCP-1和VEGF-A分泌增加，ICAM-1未达显著。将ZNF865-KRAB注射入L4-L5或L5-L6 IVD后，5周时机械痛敏显著增加，8周时热痛敏增加；L4-L5椎间盘高度显著降低，L5-L6未达显著；退变评分增加，NP和AF区域p16、VEGF、IL-6和H2AX染色增加。疼痛行为与H2AX、p16等增加相关，支持ZNF865下调通过DNA损伤/衰老相关机制诱导DDD和疼痛。

讨论总结：该研究首次对ZNF865进行功能表征，显示其广泛表达并作为细胞衰老、DNA修复和细胞周期调控的核心调节因子。ZNF865表达随年龄和DDD病理下降，与DNA损伤和衰老增加相关。CRISPRa/i表明ZNF865表达可调控，下调诱导衰老、DNA损伤和SASP，上调则逆转这些表型，并恢复基因表达和染色质可及性至更健康状态。体内敲低ZNF865可在无机械损伤情况下诱导疼痛和退变，提示分子功能障碍是椎间盘源性疼痛的重要驱动因素。COL6A2等基因变化将ZNF865与ECM沉积联系起来。研究人员认为ZNF865是DDD和相关衰老疾病潜在治疗靶点，但未来仍需ChIP-seq、阻断抗体/抑制剂/激活剂开发、不同敲低水平、时间点、原代细胞类型和疾病模型验证，并需更大临床研究。

研究结论翻译：总体而言，这项工作还突出CRISPR基因调控策略用于探究未知基因功能，并鉴定ZNF865为调控细胞周期和DNA修复机制的重要基因，对DDD相关疼痛和其他衰老相关退行性疾病具有重要意义。该研究是理解ZNF865基因基础生物学的第一步，并确立了理解ZNF865失调对于疾病病理以及作为DNA损伤/衰老相关疾病潜在治疗靶点的重要性。