《HUMAN MUTATION》：Somatic Mutation–Informed Transcriptional Architecture of Hepatocellular Carcinoma: A Multiomics Study Centered on TP53
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肝细胞癌（HCC）以广泛的体细胞突变（somatic mutation）异质性为特征，然而复发性驱动突变相关转录程序运作的细胞背景仍未完全明确。在本研究中，研究人员应用以TP53为中心的突变信息多组学（multiomics）框架，将体细胞突变状态、bulk转录
肝细胞癌（HCC）以广泛的体细胞突变（somatic mutation）异质性为特征，然而复发性驱动突变相关转录程序运作的细胞背景仍未完全明确。在本研究中，研究人员应用以TP53为中心的突变信息多组学（multiomics）框架，将体细胞突变状态、bulk转录程序和单细胞分辨率下的肝细胞样细胞状态联系起来。来自TCGA-LIHC队列的体细胞突变谱和转录组数据用于构建方向性突变相关转录特征（directional mutation-associated transcriptional signatures），CTNNB1保留为参考驱动特征，AXIN1和ARID1A保留用于描述性比较。随后，将这些bulk来源的转录程序投射到单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中，以评估肝细胞样群体中推断的TP53相关转录活性。TP53突变相关转录程序富集于增殖相关通路、DNA修复过程和应激反应程序，并与不良临床结局相关。在单细胞水平，推断的TP53相关转录活性在肝细胞样群体中呈异质性分布，并优先富集于推定的恶性肝细胞样状态。Pseudobulk（伪bulk）和功能程序分析进一步支持TP53高特征状态、细胞周期活性、DNA修复、应激程序以及改变的肿瘤细胞通讯模式之间的关联。整合优先级分析识别出CDCA8、MCM10和TRIP13作为与TP53相关转录程序相关的代表性基因；这些基因应被解释为TP53相关增殖性转录状态的组成部分，而不是经实验验证的驱动因子。这些发现提供了HCC转录架构的突变信息视角，并说明bulk突变相关特征如何与单细胞数据整合以改善体细胞变异的生物学解释。
肝细胞癌（HCC）具有实质性基因组复杂性和广泛体细胞突变异质性，仍是全球癌症相关死亡的主要原因。大规模测序研究显示，HCC反复发生影响细胞周期控制、Wnt信号、染色质重塑和基因组稳定性的关键调控通路体细胞突变。其中TP53和CTNNB1是最常改变的驱动基因，并定义HCC主要分子亚类。尽管HCC基因组景观已被广泛描述，但反复体细胞突变在多大程度上塑造肿瘤转录组织和细胞异质性仍不完全清楚。TP53通过DNA损伤反应、凋亡和细胞周期调控维持基因组稳定性；TP53突变与侵袭性表型、增殖活性增加和不良临床结局相关。既往TP53突变与野生型肿瘤转录差异多来自bulk肿瘤分析，而bulk转录组代表异质性肿瘤细胞群体的平均信号，突变相关转录程序运作的细胞背景仍未充分表征。多组学进展使体细胞突变数据与bulk转录组整合、单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析细胞分辨率异质性成为可能，但连接突变衍生转录特征与单细胞肝细胞状态的分析仍有限。因此，研究人员开展以TP53为中心的多组学分析框架，构建方向性突变相关转录特征，并投射到独立单细胞图谱，以定位TP53相关转录活性并优先候选基因。该研究的意义在于提供突变信息视角，连接bulk与单细胞数据，改善体细胞变异的生物学解释。
关键技术方法概括：研究人员使用TCGA-LIHC的体细胞突变、RNA测序和临床注释，结合GSE149614 scRNA-seq（正常肝、原发肿瘤、门静脉癌栓PVTT和淋巴结样本）及GSE14520外部bulk数据。保留功能变异，计算突变频率和肿瘤突变负荷（TMB），用maftools汇总。以limma-voom建模调整性别、病理分期和标准化log1p TMB，构建每个突变40个上调和40个下调基因的方向性特征。将bulk特征投射到肝细胞区室，定义TP53高/低评分细胞，进行pseudobulk差异表达、Hallmark基因集富集分析（GSEA）、CellChat通讯推断和逐步候选基因优先。统计用R 4.5.1及Benjamini–Hochberg校正等。
3.1 肝细胞癌体细胞突变景观与候选驱动基因特征：研究人员对TCGA-LIHC原发肿瘤患者水平非同义和功能变异分析发现，368例原发肿瘤中312例（84.78%）至少携带一个非同义突变。TP53（28.5%）和CTNNB1（25.5%）突变频率最高，其后为TTN（24.2%）、MUC16（16.0%）、ALB（12.8%）、PCLO（11.1%）；AXIN1和ARID1A分别为7.1%和7.3%。四基因改变见于215/368（58.42%）肿瘤。错义突变占主导，C>T转换最常见，TMB呈右偏分布。TP53与CTNNB1互斥，AXIN1与CTNNB1互斥，ARID1A相互作用有限。基于患病率、临床相关性和统计效能，TP53作为中心，CTNNB1为参考，AXIN1和ARID1A用于描述比较。
3.2 突变相关转录特征可分层突变状态：通过调整突变相关差异表达，研究人员构建TP53和CTNNB1方向性特征，每个由40个上调和40个下调基因组成。突变携带者评分显著高于野生型；受试者工作特征（ROC）分析显示TP53和CTNNB1特征区分突变状态AUC分别为0.803和0.915。TP53突变肿瘤TP53评分较高而CTNNB1评分较低，CTNNB1突变肿瘤呈相反模式，说明特征捕获突变相关转录差异。
3.3 突变相关转录特征的临床和生物学关联：逻辑回归显示调整临床协变量后，TP53和CTNNB1评分仍与突变状态相关；病理分期中两特征评分存在差异，TP53评分在晚期肿瘤更高，CTNNB1呈反向。生存分析显示TP53高评分肿瘤总生存更差（log-rank p=0.009），CTNNB1评分无显著关联。Cox回归中TP53评分与死亡风险增加相关，CTNNB1无显著关联。Hallmark分析显示TP53评分与MYC targets、DNA repair、E2F targets和G2M checkpoint正相关；CTNNB1与多个此类程序负相关。免疫/基质程序上，TP53评分与若干免疫程序正相关，CTNNB1与多个免疫和基质程序负相关。
3.4 肝细胞癌单细胞肝细胞转录状态表征：对GSE149614 scRNA-seq分析，质控显示组织部位间检测基因、转录本和线粒体比例分布可比。聚类识别肝细胞、T/NK细胞、髓系细胞、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞；肝细胞在肿瘤和PVTT中占主导，免疫群体在正常肝和淋巴结更突出。肝细胞再聚类显示多个亚簇，组织分布不同，分为正常样、推定恶性肝细胞样和中间状态。程序分析显示肝功能、应激、oncofetal和增殖程序差异，MKI67在特定簇富集，ALB和APOA1在另一些簇富集。
3.5 突变相关转录特征投射至肝细胞单细胞状态：研究人员将bulk来源TP53特征评分投射到肝细胞区室，解释为推断的TP53相关转录活性而非单细胞突变状态。该活性在肝细胞簇间异质分布，并富集于推定恶性肝细胞样群体。在推定恶性细胞中，TP53和CTNNB1评分呈弱负相关（Spearman rho=-0.05）。TP53高评分上四分位细胞主要位于特定簇，且TP53评分与细胞周期、增殖和应激程序正相关；高评分细胞增殖和应激程序更高，低评分细胞肝功能程序更高。这支持TP53相关活性的定位，但不建立单细胞TP53突变状态。
3.6 TP53高特征肝细胞群体的pseudobulk和细胞互作分析：为减少供者偏倚，研究人员按患者聚合推定恶性肝细胞样细胞的TP53高/低评分组进行pseudobulk分析。主成分分析（PCA）显示高/低组分离，差异表达和热图显示一致差异。高评分细胞上皮-间充质转化（EMT）、干性、缺氧和糖酵解程序更高，低评分细胞氧化磷酸化和正常肝程序更高；GSEA显示高评分富集E2F targets、G2M checkpoint、MYC targets和DNA repair，低评分富集代谢程序。CellChat探索性分析显示TP53高特征恶性肝细胞样细胞具有不同的预测通讯模式，但这些为计算预测。
3.7 TP53相关候选基因的优先排序和计算支持：从701个TP53上调基因出发，经单细胞可检测性、细胞类型特异性、TCGA bulk支持、混杂过滤和预后关联逐步过滤，最终识别CDCA8、MCM10和TRIP13。三者在TP53高评分恶性肝细胞样细胞中表达更高，单细胞中优先表达于推定恶性肝细胞样亚群，TCGA中TP53突变肿瘤表达更高，与TP53特征评分强正相关，并与DNA repair、E2F targets和G2M checkpoint相关。高表达与更差总生存相关，时间依赖ROC显示中等预后性能。由于与细胞周期密切相关，这些基因应解释为TP53相关增殖转录程序的代表性标志，而非实验验证驱动因子。
讨论认为，理解反复体细胞突变如何塑造肿瘤转录组织仍是癌症基因组学挑战。既往研究多依赖bulk肿瘤，本研究新颖性在于跨基因组、bulk转录组和单细胞转录尺度的突变信息整合，而非仅识别TP53相关差异表达。结果与TP53维持基因组稳定和调控细胞周期作用一致；TP53功能丧失可能促进基因组不稳定和不受控增殖，解释增殖程序富集，DNA修复和应激反应关联支持其协调基因组损伤反应。单细胞投射提示TP53相关活性非均匀分布，而优先富集于具有增殖和应激活性的推定恶性肝细胞样状态；因突变状态由bulk衍生程序推断而非单细胞直接测量，应解释为定位。多组学框架提供连接基因组改变与跨尺度转录组织策略。候选基因CDCA8、MCM10和TRIP13分别与染色体分离、DNA复制起始和纺锤体检查点调控相关，但均与增殖相关，不能证明为独立TP53特异性驱动因子。局限包括回顾性公共数据偏倚、单细胞突变状态未直接测量、拷贝数推断未纳入、候选基因未qPCR/蛋白/功能验证、CellChat为预测、队列差异限制泛化。未来需匹配单细胞基因组和转录组、直接实验验证和独立前瞻队列。
结论翻译：本研究通过整合多组学分析，定义了HCC中与TP53改变相关的突变信息转录框架。这些发现为肿瘤转录异质性提供视角，并有助于改善对体细胞突变相关转录程序的解释。
