YTHDC1在肝细胞癌中的细胞与免疫微环境：单细胞与多队列整合研究

《International Journal of Genomics》：The Cellular and Immune Context of YTHDC1 in Hepatocellular Carcinoma: A Single-Cell and Multicohort Study

背景：YTHDC1是一种参与RNA加工的核内N6-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）读取器。其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中的丰度、细胞分布以及与免疫微环境的关系仍未完全阐明。

方法：研究人员整合了配对肿瘤-癌旁转录组和蛋白质组队列、三个包含249,080个质控合格细胞的单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）数据集、四个结局队列、三个免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）队列、配对临床标本以及基于细胞的YTHDC1敲低实验。患者水平分析涵盖了肝细胞程序、免疫状态、表达支持的配体-受体轴、生存、ICI应答以及探索性单细胞网络扰动。

结果：在160对CPTAC样本中，YTHDC1蛋白丰度更高（Hedges′ g = 1.21，95%置信区间（confidence interval, CI）1.01–1.42），而RNA效应在各队列间存在差异。单细胞分析将YTHDC1定位于肝脏和免疫区室，并确定了其与肝细胞、淋巴样和髓样程序的患者水平关联。在预设的肝细胞至髓样轴中，SPP1–CD44获得了最强的跨队列表达支持。一个转移的肝细胞状态显示合并的肿瘤-癌旁效应为g = 0.42（95% CI 0.04–0.80），且YTHDC1丰度较高与较差的总体生存期相关（风险比（hazard ratio, HR）1.20，95% CI 1.06–1.36；基于研究的单变量模型）。在37例接受ICI治疗的患者中，YTHDC1的合并应答者-非应答者效应较小（g = 0.05，95% CI ?0.60至0.71）。探索性虚拟敲除显示跨队列网络扰动排名具有适度一致性。配对临床组织支持YTHDC1 mRNA和蛋白丰度增加，YTHDC1沉默在两个HCC细胞系中降低了增殖相关读数和THP-1迁移。

结论：YTHDC1在HCC中蛋白水平升高，并存在于可识别的肝细胞和免疫程序中。功能实验支持其在所测条件下对HCC细胞增殖和肿瘤细胞依赖性巨噬样细胞迁移的贡献。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管手术、移植、局部消融以及经动脉和系统治疗不断进展，但免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）的持久获益仍局限于部分患者，临床上缺乏经过验证的分子标志物来指导ICI联合方案的选择。YTHDC1是一种核内N6-甲基腺苷（m⁶A）读取器，参与前体mRNA剪接和甲基化转录本的核输出，可能通过影响RNA加工而调控细胞状态与肿瘤行为。已有研究提示YTH域蛋白与HCC预后及免疫浸润相关，但YTHDC1在RNA和蛋白质层面的丰度变化、其在肝细胞与免疫区室中的精确分布及其与肿瘤微环境的关系仍未被系统刻画。为此，研究人员整合了多平台公共数据和独立临床标本，对YTHDC1进行了从组织水平到细胞水平再到功能实验的系统分析。

研究人员整合了配对肿瘤-癌旁转录组（TCGA-LIHC、ICGC LIRI-JP、GSE14520）和蛋白质组（CPTAC）队列，三个单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）数据集（GSE149614、GSE290925、GSE112271，共249,080个质控细胞），四个生存队列，三个ICI治疗队列（GSE202069、GSE215011、GSE279750），配对临床标本，以及Huh-7和MHCC-97H两个HCC细胞系的YTHDC1敲低实验。采用患者为推断单元的分析策略，评估了肝细胞程序、免疫状态、配体-受体轴、生存、ICI应答和网络扰动。研究发现YTHDC1蛋白丰度在配对肿瘤中一致升高（160对CPTAC样本的Hedges′ g = 1.21），而RNA效应在不同队列间呈异质性。单细胞分析将YTHDC1定位于肝细胞和多种免疫细胞，并识别出与肝细胞、淋巴样和髓样程序的患者水平关联。在预设的肝细胞-髓样配体-受体轴中，SPP1–CD44获得最强的跨队列表达支持。由24个基因构成的转移肝细胞状态在肿瘤中升高，且包含明显的增殖成分。研究感知的生存分析显示，YTHDC1丰度较高与较差的总生存期相关（HR 1.20，95% CI 1.06–1.36）。在37例ICI治疗患者中，YTHDC1本身与应答的合并效应接近零，而CD274和若干免疫程序呈现正向但置信区间较宽的估计。配对临床标本的qRT-PCR、Western blot和免疫组化进一步验证了YTHDC1在HCC组织中mRNA和蛋白水平的升高。功能实验中，使用两种独立siRNA沉默YTHDC1后，两个HCC细胞系的CCK-8增殖读数、EdU阳性比例均降低，同时THP-1巨噬样细胞向肿瘤细胞的迁移减少。该研究的意义在于提供了跨平台、患者水平的整合证据，强调了对YTHDC1进行蛋白层面验证的必要性，并提示其可能作为机制研究靶点，而非直接的预测性生物标志物。

关键技术方法包括：配对转录组和蛋白质组分析采用Hedges′ g和随机效应模型进行研究感知合成；单细胞数据经质控和harmonization后构建t-SNE图谱，通过患者分块伪bulk进行edgeR差异表达分析和竞争性基因集富集；24基因状态评分在bulk队列中标准化投影；Cox回归用于生存分析；ICI应答使用Hedges′ g合并；网络虚拟敲除采用scTenifoldKnk评估扰动一致性；实验验证包括qRT-PCR、Western blot、免疫组化、CCK-8、EdU和Transwell迁移。样本队列来源包括TCGA、ICGC、CPTAC、GEO公共数据库以及重庆医科大学附属第二医院的配对临床标本。

3.1 多队列分析确定YTHDC1的组织水平丰度模式：配对分析显示TCGA-LIHC和ICGC中RNA轻度升高，GSE14520平台呈降低，而CPTAC蛋白显著升高（g = 1.214），RNA随机效应合成显示高度异质性，提示蛋白层面更为一致。

3.2 单细胞图谱定位YTHDC1在肝细胞和免疫区室的分布：质控后249,080个细胞构建共享基因图谱，YTHDC1在肝细胞及T/NK、B、髓样等区室均有检测，患者间水平存在差异，且通过CNV敏感性分析支持肿瘤样本肝细胞的定义。

3.3 患者分块分析揭示深度敏感的肝细胞程序：基于患者分块的伪bulk差异表达仅显示少量基因达到显著性，原始增殖、E2F和MYC程序评分在YTHDC1高表达肝细胞中升高，但残差化后效应减弱，表明主要受文库复杂度影响。

3.4 免疫细胞程序将YTHDC1置于患者特异性免疫背景中：肝细胞YTHDC1与免疫细胞丰度和程序评分的关联方向混合，其中GSE149614中与炎症评分正相关（ρ = 0.661），GSE290925中与干扰素评分负相关（ρ = ?0.713）。

3.5 髓样状态图谱识别可重复生态组分：髓样细胞分为C1QC/FOLR2、FCN1单核、炎症、干扰素和SPP1/TREM2五类状态，患者间比例和YTHDC1表达存在异质性，肝细胞YTHDC1与髓样读数关联大多未通过FDR校正。

3.6 跨队列表达支持优先SPP1-CD44轴：12个预设轴中SPP1–CD44获得最高跨队列优先级（1.000），排列在留一患者分析中稳定，但未发现YTHDC1与轴评分间的显著关联。

3.7 转移的肝细胞状态捕获增殖相关组织信号：24基因状态在配对bulk队列中肿瘤高于癌旁（合并g = 0.418），去除YTHDC1后仍保持正向，去除四个增殖相关基因后翻转，提示其反映更广泛的增殖性组织程序。

3.8 研究感知结局分析关联YTHDC1与总生存：四个队列合并单变量HR为1.202，I² = 0，留一研究分析范围1.157–1.234；调整分期、年龄、性别后TCGA中HR减弱至1.127，并检测到比例风险假设信号。

3.9 ICI队列确定YTHDC1及免疫程序的应答相关范围：三个ICI队列共37例患者，YTHDC1合并应答者-非应答者效应为g = 0.055（CI ?0.600至0.710），CD274为0.601，免疫程序效应为0.318–0.627，置信区间较宽。

3.10 网络虚拟敲除表征跨队列扰动一致性：虚拟敲除在GSE149614和GSE290925中显示跨队列全基因秩相关ρ = 0.238（p = 8.57 × 10^?17），Top 10%基因重叠显著，但显著基因数量少，与匹配对照基因的扰动幅度相当。

3.11 配对临床标本确认HCC中YTHDC1丰度增加：qRT-PCR（20对）、Western blot（5对）和免疫组化（20对）均显示肿瘤中YTHDC1 mRNA或蛋白升高。

3.12 YTHDC1沉默降低HCC细胞增殖和THP-1迁移：两种siRNA在Huh-7和MHCC-97H中均降低YTHDC1表达，并显著降低CCK-8吸收值、EdU阳性比例及THP-1巨噬样细胞迁移数量。

讨论指出，RNA与蛋白层面的不一致提示YTHDC1存在转录后调控，蛋白丰度可能更反映其功能状态。单细胞分析中增殖程序与文库复杂度混杂，而转移状态进一步支持YTHDC1相关的广泛增殖性组织信号。SPP1–CD44轴作为稳定的表达支持候选，具有机制研究价值。生存分析支持YTHDC1作为与结局相关的连续特征，但调整后效应减弱，不适宜直接作为预后模型。ICI分析显示YTHDC1的免疫背景在队列间变异，提示其参与免疫调节但并非单一应答预测因子。网络虚拟敲除仅提供探索性证据，不能推断因果关系。结论翻译：YTHDC1在HCC中蛋白水平升高，并与独立患者队列中的细胞、免疫和结局特征相关。其沉默降低增殖相关读数和肿瘤细胞依赖性巨噬样细胞迁移，支持进一步机制和临床协调评估。