《Ecology and Evolution》：Characteristics of Microbiota in Different Segments of the Digestive Tract of Orange-Collared Keelback (Rhabdophis himalayanus)
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动物的胃肠道在消化和营养吸收中起着至关重要的作用。肠道微生物群的多样性对于维持动物的生理功能至关重要。然而，当前的研究主要集中在哺乳动物上；关于爬行动物，特别是蛇类肠道微生物群的研究仍然有限。本研究利用宏基因组测序（metagenomic sequencing
动物的胃肠道在消化和营养吸收中起着至关重要的作用。肠道微生物群的多样性对于维持动物的生理功能至关重要。然而，当前的研究主要集中在哺乳动物上；关于爬行动物，特别是蛇类肠道微生物群的研究仍然有限。本研究利用宏基因组测序（metagenomic sequencing）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）技术，调查了喜马拉雅颈槽蛇（Rhabdophis himalayanus）胃、大肠和小肠中的微生物群落组成及功能潜力。结果表明，在R. himalayanus肠道微生物群中，三个最优势的门是假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）和芽孢杆菌门（Bacillota）。此外，对胃、小肠和大肠微生物群落的分析显示，这三个区域的α多样性和β多样性均无显著差异。线性判别分析效应大小（LEfSe）揭示了肠道微生物丰度的显著差异。MetaStats分析进一步揭示了微生物分类单元和碳水化合物活性酶（CAZymes）丰度的显著差异。尽管各胃肠道区域之间的整体代谢物谱没有显著差异，但成对分析鉴定出了与氨基酸、脂质、核苷酸和辅因子代谢相关的差异丰度代谢物。来自消化道不同部位的肠道微生物群可能揭示了R. himalayanus肠道微生物组的独特特征以及微生物群落结构对功能的影响。总之，这些发现拓展了研究人员对一种研究不足的蛇类胃肠道微生物群落及其相关功能潜力的理解。
论文解读文章
1. 研究背景与研究目的
动物胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）由多个区室构成，如胃、小肠和大肠，各自具有独特的理化条件，这可能支持区域特异性的微生物群落。然而，以往的研究多集中于粪便样本，其主要代表远端肠道微生物群，可能忽略了不同GIT区域间的微生物变异。此外，GIT微生物组研究的物种分类缺口巨大：迄今为止，研究主要集中在哺乳动物、鱼类和鸟类上。蛇类作为一个多样化的脊椎动物谱系，具有包括消化可塑性在内的生理适应性，使其能够在长期禁食后快速恢复胃肠功能，这种显著的适应能力可能由肠道微生物介导的代谢可塑性所促进。然而，仅有少数野生蛇类的肠道微生物组被研究过。喜马拉雅颈槽蛇（Rhabdophis himalayanus）是一种卵生蛇类，分布于西藏和云南，种群数量相对较小，其胃肠道微生物组尚未得到充分表征。该物种主要以蛙类和蟾蜍为食。鉴于其有限的种群分布和隐蔽的生境偏好给野外采样带来了巨大挑战，本研究旨在通过宏基因组测序和非靶向代谢组学技术，初步探索其消化道微生物群落的结构组成与功能潜力，以增进对蛇类肠道微生态的理解，并为蛇类胃肠道微生物组成和功能潜力提供新的见解。
2. 主要关键技术方法
研究人员从西藏自治区墨脱县采集了3只野生R. himalayanus个体。在禁食处理后，分别收集其胃（RHW）、小肠（RHX）和大肠（RHD）内容物，共获得9份样本。研究采用宏基因组鸟枪法测序（metagenomic shotgun sequencing）对DNA进行分析，并使用MEGAHIT软件进行组装，MetaGeneMark预测开放阅读框（ORFs），CD-HIT构建非冗余基因集。物种注释通过DIAMOND软件比对microNR数据库完成，功能注释则比对CAZy和eggNOG数据库。同时，采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）技术进行非靶向代谢组学分析，代谢物鉴定匹配mzCloud、mzVault和MassList数据库。
3. 研究结果
3.1 喜马拉雅颈槽蛇胃肠道微生物群测序
研究共获得9套胃肠道测序数据。经质量控制和宿主序列过滤后，平均获得6.39 ± 0.24 Gb的高质量数据，其中Q30碱基比例平均为93.88% ± 0.32%。韦恩图分析显示，三组间共有650,624个重叠基因簇，而RHX组（小肠）独有的基因簇数量（5,998个）高于RHD组（大肠，2,817个）和RHW组（胃，3,871个）。
3.2 喜马拉雅颈槽蛇胃肠道微生物多样性
Alpha多样性分析显示，所有样品的Good's覆盖指数均大于99.9%，表明测序深度足够。胃、小肠和大肠之间的α多样性指数（ACE、observed species、Shannon、Simpson）无显著差异（p > 0.05）。NMDS分析（stress值=0.089）和Adonis检验（R2=0.288, p=0.323）也表明各组间微生物群落结构无显著差异。
3.3 不同胃肠道区段微生物组成与结构的比较分析
在门水平上，胃肠道微生物群中最优势的五个门依次为假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、芽孢杆菌门（Bacillota）、弯曲菌门（Campylobacterota）和拟杆菌门（Bacteroidota）。在属水平上，最优势的五个属依次为埃希氏菌属（Escherichia）、分枝杆菌样属（Mycobacteroides）、弯曲菌属（Campylobacter）、诺卡氏菌属（Nocardia）和海球菌属（Thalassococcus）。热图分析显示，大肠中有14个微生物属的相对丰度高于小肠，胃中有2个属的丰度高于大肠，小肠中有19个属的丰度高于胃。MetaStats分析鉴定出各区段间存在差异的属和种，例如Veillonella在胃中相对丰度更高，而多种拟杆菌属（Bacteroides）物种在小肠中显著富集。LEfSe分析（LDA score > 2, p < 0.05）揭示，相较于胃（3个生物标志物），小肠（10个生物标志物）拥有更多的显著差异微生物标志物。
3.4 功能分析
eggNOG功能注释表明，野生蛇类肠道微生物组的功能主要集中在未知功能（S）、氨基酸转运与代谢（E）、复制、重组与修复（L）以及碳水化合物转运与代谢（G）类别。CAZy注释显示，糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs）占比最大，其次是糖基转移酶（glycosyltransferases, GTs）和碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules, CBMs）。其中，CBM14和GH18家族丰度最高。MetaStats分析比较了CAZy家族的相对丰度，在小肠和大肠之间发现了12个CAZy家族的相对丰度存在显著差异。
3.5 代谢组学分析
PCA分析和PERMANOVA检验（R2=0.351, p=0.052）表明，虽然QC样品聚类良好，但三组间的整体代谢物谱未达到统计学上的显著分离。火山图筛选出正负离子模式下各组间的差异丰度代谢物。KEGG通路富集分析显示，这些差异代谢物主要与氨基酸代谢（如色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢）、脂质代谢（如不饱和脂肪酸的生物合成）、核苷酸代谢和辅因子代谢（如烟酸和烟酰胺代谢）等通路相关。
4. 讨论与结论
讨论总结：作为专性肉食动物，蛇类高蛋白、低碳水化合物的饮食习性塑造了其独特的肠道微生物群落结构与功能。本研究发现，R. himalayanus的胃、小肠和大肠共享若干优势微生物分类单元，且微生物多样性无显著差异，但MetaStats和LEfSe分析揭示了低丰度微生物在区段间的相对丰度差异。假单胞菌门（Pseudomonadota）作为优势菌门，在其他脊索动物（如鸟类）及多种蛇类中也普遍存在，暗示其在蛇类代谢系统中的重要作用。放线菌门（Actinomycetota）在R. himalayanus中比例升高，这一现象也在某些鸟类和蛇类中被观察到，反映了宿主进化史与生态生理因素可能共同影响脊椎动物肠道微生物组成。功能方面，CAZy注释中高丰度的CBM14和GH18家族提示微生物具备潜在的几丁质结合与降解能力，这与R. himalayanus捕食蛙类（其猎物可能摄入含几丁质的节肢动物）的食性相符。尽管整体代谢物谱无显著差异，但成对比较发现的差异代谢物主要富集于氨基酸、脂质、核苷酸和辅因子代谢通路，这反映了不同胃肠道区段微环境下的代谢重编程。研究者也指出了样本量有限的局限性，认为这是对R. himalayanus消化道微生物组的初步探索。
研究结论翻译：这项探索性研究表征了三只喜马拉雅颈槽蛇（Rhabdophis himalayanus）个体的胃肠道微生物群落、宏基因组功能潜力和代谢物谱。LEfSe和MetaStats分析鉴定了不同胃肠道区域间微生物群落组成的差异。此外，MetaStats分析揭示了不同胃肠道区域间CAZy家族相对丰度的变化。代谢组学分析进一步表明，差异代谢物与涉及氨基酸、脂质、核苷酸和辅因子代谢的通路相关。总体而言，这些发现描述了R. himalayanus胃肠道区域肠道微生物群的分类组成和功能潜力，以及胃肠道内容物的代谢物谱。这项研究扩展了关于这种研究不足的蛇类胃肠道微生物组的现有信息，并为未来研究蛇类微生物群落和消化生理学提供了参考。
