《Journal of Neuroendocrinology》：Proteomic profiling identifies candidate biomarkers for small intestinal neuroendocrine tumours G1 and G2
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虽然小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumours，SI-NET）Grade 1（G1）和Grade 2（G2）常被一起研究，但其临床病程和治疗反应可能不同。研究人员假设这些肿瘤组在血液中表达不同的标志物，可
虽然小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumours，SI-NET）Grade 1（G1）和Grade 2（G2）常被一起研究，但其临床病程和治疗反应可能不同。研究人员假设这些肿瘤组在血液中表达不同的标志物，可能为未来治疗策略提供信息。使用邻近延伸分析（proximity extension assay，PEA）（Olink，Uppsala，Sweden）分析了107例SI-NET患者（G1 n=64，G2 n=43）和50例健康对照的血液。使用两个肿瘤学蛋白质panel。采用回归分析和机器学习算法（Random Forest、Boruta）分析结果。在年龄调整分析中，188种蛋白质在患者与健康对照间存在差异，其中大多数在患者中升高。6种蛋白质在G2与G1患者中升高。调整年龄后，Retbindin（RTBDN）、Cryptic family protein 1（CFC1）和Calbindin 1（CALB1）仍显著，而调整年龄和分期后仅RTBDN显著。在仅限IV期的分析中，RTBDN在G2中高于G1（estimate 1.688；95% CI 0.796–2.580；p <0.001）。RTBDN和Midkine（MDK）与较差生存相关，而Integrin subunit alpha V（ITGAV）则相反。在G1/G2分析中，调整年龄和分期后，RTBDN成为唯一与肿瘤分级相关的候选生物标志物。在仅限IV期的分析中，RTBDN仍是排名最高的蛋白质，并显示相似方向的关联，但未达到严格的Bonferroni校正显著性阈值。较高的RTBDN水平还与死亡风险增加相关。这些发现是探索性的，在临床应用前需要独立验证。
研究背景：神经内分泌肿瘤（neuroendocrine tumours，NETs）起源于多种器官的神经内分泌细胞。根据WHO分类，分化良好的NETs按增殖率分为G1（Ki-67 <3%）、G2（Ki-67 3–20%）和G3（Ki-67 >20%），另有一组为罕见低分化的神经内分泌癌（neuroendocrine carcinomas，NEC；Ki-67 >20%）。肿瘤还用肿瘤-淋巴结-转移（tumour-node-metastasis，TNM）分期系统分为I–IV期。小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumours，SI-NET）罕见、通常生长缓慢，即使转移也可长期生存。SI-NET起源于肠嗜铬细胞，可合成和分泌血清素、速激肽等生物活性胺和肽，水平升高可导致类癌综合征。SI-NET诊断常延迟数年，许多患者就诊时已有转移。当前常用生物标志物为嗜铬粒蛋白A（chromogranin A，CgA）和5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA），但CgA缺乏特异性；NETest为基于PCR的多分析物检测，但其临床用途尚未确定。既往PEA研究在SI-NET中发现与生存相关蛋白或提出多生物标志物策略，但尚无新生物标志物进入临床。G1肿瘤比G2常见约四倍，且G2更具侵袭性，可能分子特征不同；多数SI-NET研究将G1和G2合并或仅关注G1，结果能否外推至G2仍不确定。因此，研究人员假设G1与G2 SI-NET蛋白表达差异可发现新分子生物标志物，有助于理解肿瘤进展与侵袭性，并用于诊断工具和治疗策略开发。研究人员开展了基于血清PEA蛋白质组学的研究，比较SI-NET患者、G1与G2以及健康对照，得出RTBDN等候选蛋白与肿瘤分级和生存相关，但研究为探索性，需独立验证。
关键技术方法（不超过250字）：研究纳入前瞻性收集的NET患者血清，均在诊断后1个月内、任何疾病特异性治疗前采集并保存于?80°C；初始110例SI-NET中排除3例溶血样本，最终107例（G1 n=64，G2 n=43），对照为50例健康献血者血清，来自3H Biomedical AB（Uppsala，Sweden），附性别和年龄信息。样本使用Olink Explore 384 Oncology-I和Oncology-II panel，通过邻近延伸分析（proximity extension assay，PEA）在SciLifeLab（Uppsala，Sweden）分析。统计分析由Uppsala Clinical Research Center完成，包括未调整和调整线性回归、仅IV期敏感性分析、Kaplan–Meier法、未调整和调整Cox回归、Boruta算法及随机森林（Random Forest）特征选择、火山图，并采用严格Bonferroni校正。
研究结果：
患者与健康对照的蛋白质水平：通过PEA比较患者与健康对照，未调整分析中244种蛋白质通过Bonferroni阈值，其中150种上调、94种下调；调整年龄后188种差异表达，117种上调、71种下调。顶级差异蛋白中，Carboxylesterase 2（CES2）、IQ motif-containing GTPase-activating protein（IQGAP2）、Metastasis suppressor protein 1（MTSS1）和Mesothelin（MSLN）在患者中显著较低，而DnaJ Heat Shock Protein Family (Hsp40) Member B1（DNAJB1）、CFC1和Hydroxymethylbilane synthase（HMBS）在患者中显著较高。火山图展示多重校正后显著结果，表2列出未调整和调整分析中最高显著性蛋白。
G1与G2肿瘤的蛋白质水平：未调整分析中，6种蛋白在G2与G1患者间血液水平显著不同：RTBDN、CALB1、CFC1、Seizure 6-like protein 2（SEZ6L2）、Leiomodin-1（LMOD1）和Chemokine-like protein TAFA-5（TAFA5），均在G2中更高。调整年龄后，RTBDN、CALB1和CFC1仍显著；调整年龄和疾病分期后，仅RTBDN达到统计学显著性。在仅限IV期的敏感性分析中，RTBDN在G2中高于G1（estimate 1.688；95% CI 0.796–2.580；p=0.000436），方向与主分析一致，但该亚组分析中无蛋白通过Bonferroni校正。G1/G2与健康对照比较显示，CES2、IQGAP2、MTSS1、MSLN、DNAJB1在G1和G2肿瘤中表达相似，但与健康个体差异表达；CFC1、RTBDN、CALB1从健康对照到G1到G2逐渐升高。
随机森林和Boruta算法的变量选择：通过Boruta算法进一步研究差异表达蛋白，Boruta识别出198种蛋白在患者与健康个体间显著不同，14种蛋白在G1与G2肿瘤间显著不同。结果以变量重要性图呈现，绿色标记为确认显著；表2显示线性回归识别的主要蛋白中哪些被Boruta确认。
生存分析：随访中位9.64年、最长24.08年，72例患者死亡。未调整Cox回归中13种标志物通过Bonferroni阈值，包括RTBDN、Tumour necrosis factor receptor superfamily member 27（EDA2R）、CALB1、Kallikrein-4（KLK4）、LMOD1、Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret（RET）、TAFA5、Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1（NCR3LG1）、Podocalyxin-like protein 2（PODXL2）、SEZ6L2、CFC1、MDK和Matrix metalloproteinase-12（MMP12）。年龄调整后，RTBDN、CALB1、Myosin phosphatase Rho-interacting protein（MPRIP）和CFC1通过阈值。年龄和分期共同调整后，RTBDN、MDK和ITGAV通过阈值；较高RTBDN（HR 1.442；95% CI 1.246–1.669）和MDK（HR 1.914；95% CI 1.416–2.587）与死亡风险增加相关，较高ITGAV与死亡风险降低相关（HR 0.161；95% CI 0.066–0.390）。Kaplan–Meier曲线按RTBDN四分位分层展示。
讨论总结：该研究使用Olink PEA方法在SI-NET患者血清中识别潜在新生物标志物，聚焦健康个体、SI-NET G1和G2患者比较。RTBDN、MDK和ITGAV在生存分析中为显著区分因子；CES2、CFC1、CALB1和LMOD1等也可能值得进一步研究。RTBDN在多项分析中最显著，最初在眼组织中发现为视网膜特异性蛋白，与核黄素结合蛋白同源；核黄素是黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）前体，参与能量产生、细胞功能、生长和代谢。RTBDN可帮助在神经视网膜中浓缩FAD和FMN，Rtbdn
?/?小鼠中核黄素、FAD和FMN水平降低。人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas）显示RTBDN也存在于内分泌和胃肠道相关区域，单细胞RNA分析显示肠内分泌细胞中可检测到。癌症表达分析显示RTBDN可在多种癌症患者血液中检测，SI-NET中水平较高。该研究中患者RTBDN高于健康对照，且是调整年龄和分期后G1与G2分析中唯一显著蛋白，G2高于G1，高水平与更差生存相关；IV期亚组中RTBDN仍排名最高、方向一致但未过Bonferroni阈值。RTBDN在SI-NET血清中出现的原因和功能未知。ITGAV属整合素受体家族，多数表达研究提示与肿瘤进展和不良预后相关，但该研究发现较高ITGAV与较低死亡风险相关，且在健康对照中更高，原因不清。MDK为多功能蛋白，多种肿瘤中过表达并导致循环水平升高，与不良临床结局相关；既往PEA研究显示III/IV期G1和G2 SI-NET患者MDK血清浓度高于健康对照；本研究中MDK在IV期G2患者中高于IV期G1患者（p=0.027），但未通过Bonferroni校正，较高水平与死亡风险增加相关。其他差异蛋白面板可能区分G1与G2及预后，或可发展为液体活检策略，无需重复侵入性组织活检，但需进一步验证。优势包括特征明确的SI-NET队列、纳入G1和G2及健康对照、疾病特异性治疗前前瞻收集血清、严格多重检验校正和机器学习特征选择。局限包括G2组IV期比例高，可能混杂G1与G2比较；虽调整分期并做IV期限制敏感性分析，但肿瘤负荷和转移范围残余混杂不能排除；IV期限定后仅67例，统计效力较低，应视为支持而非确证；16个测定未达Olink质控标准被排除；缺乏独立外部验证和ELISA或靶向质谱等正交验证；Boruta不能替代外部验证；研究为发现性而非验证性；未确定RTBDN细胞或组织来源，不能确定其由SI-NET细胞产生和分泌，或反映系统性宿主反应。需更大独立队列、组织表征和正交蛋白测量进一步验证。
研究结论翻译：总之，该研究识别出多种参与不同分子通路的蛋白质，其在G1与G2 SI-NET之间以及患者与健康对照之间差异表达。这些发现可能为SI-NET发病机制提供新见解。所识别的循环蛋白质代表与肿瘤分级和临床结局相关的候选生物标志物。需要进一步研究验证这些发现，并确定其生物学和临床相关性。
