《Journal of Peptide Science》：Automation of the Azapeptide Submonomer Synthesis Method
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报道了氮杂肽（azapeptide）亚单体（submonomer）合成方法的自动化。所有用于树脂上氮杂氨基酸合成的步骤，包括缩氨基脲（semicarbazone）引入、烷基化、去保护以及氨基脲（semicarbazide）酰化，均已适配于一台市售多肽合成仪。成
报道了氮杂肽（azapeptide）亚单体（submonomer）合成方法的自动化。所有用于树脂上氮杂氨基酸合成的步骤，包括缩氨基脲（semicarbazone）引入、烷基化、去保护以及氨基脲（semicarbazide）酰化，均已适配于一台市售多肽合成仪。成功的关键要求包括：使用稳定的异氰酸酯前体进行缩氨基脲安装，在DMF中使用稳定试剂，以及消除冷却步骤。研究人员利用优化后的自动化亚单体氮杂肽合成程序，完成了超过30个氮杂肽的合成。
论文解读：自动化亚单体氮杂肽合成方法的建立与应用
**研究背景与目的**
随着多肽类药物研发管线迅速扩张，高效获取非经典氨基酸以改善候选物的治疗潜力已成为重要需求。在构效关系（SAR）研究中，将天然氨基酸系统替换为非常见氨基酸，如d-氨基酸、N-甲基氨基酸、β-氨基酸和氮杂氨基酸（aza-amino acids，即α-碳被氮原子取代的氨基酸类似物），可用于提升生物活性和蛋白酶稳定性。其中，氮杂氨基酸通过氮孤对电子排斥和脲平面性可有效刚性化生物活性构象，限制骨架二面角，因此在药物化学中具有广泛应用。然而，氮杂肽在SAR研究中的应用仍相对有限，主要瓶颈在于便捷且可自动化的合成方法缺乏。现有自动化策略包括使用稳定的Fmoc-氮杂氨基酸O-苯并三唑酯（Fmoc-azaAA-OBt）单体，该方法虽实现了首次全自动化，但每个单体的制备步骤繁多；而亚单体（submonomer）方法直接在树脂上构建氮杂氨基酸，大幅简化了合成流程，却尚未实现自动化。因此，研究人员旨在开发一种完全自动化的亚单体氮杂肽合成方案，以加速氮杂肽库的构建和SAR探索。
**关键方法**
研究人员使用市售Biotage Syro I平行多肽合成仪，配备10 mL加热块适配器，以Rink Amide-MBHA树脂为固相载体。采用N-亚胺基-O-苯基氨基甲酸酯（2）作为稳定异氰酸酯前体，在60°C加热下进行缩氨基脲安装；烷基化步骤在DMF中直接添加四乙基氢氧化铵（TEAH）水溶液，避免配制储备液；脱保护使用1.5 M羟胺盐酸盐吡啶溶液，于80°C加热块中完成；氨基酸偶联采用Oxyma/DIC体系。产物通过LCMS分析、制备型HPLC纯化，并以HRMS和NMR表征。
**研究结果**
**3.1 缩氨基脲合成的优化**
研究人员合成了稳定异氰酸酯前体2，该化合物可通过两步结晶制得，且能在DMF中稳定保存超过两周。手动固相合成条件筛选表明，室温反应16小时仅得到痕量产物；加热至60°C并使用10当量前体时，4小时转化率为65%，16小时达88%；添加HOAt和DIEA可提升至95%；将前体浓度提高至2 M后，60°C反应2小时即可实现>99%粗品纯度。最终确定2 M前体、60°C、2小时作为自动化标准条件。
**3.2 缩氨基脲烷基化的优化**
以苯甲醛腙-Phe（4）为模型底物，在自动化合成仪上评估烷基化条件。当TEAH和苄溴均以储备液形式加入时，未检测到烷基化产物；将TEAH直接加入反应柱但溶剂为THF时，仍未发生反应，这与TEAH在THF中溶解度有限及涡旋混合强度不足有关。改用DMF作为溶剂并直接加入TEAH后，2小时内实现>99%转化率，获得烷基化产物5。该步骤确立了DMF作为反应溶剂和TEAH直接添加的必要性。
**3.3 缩氨基脲脱保护和酰化**
脱保护在加热块上进行，温度由60°C提高至80°C，反应时间从2×8小时缩短为2×6小时，且平行操作的可靠性优于加热超声浴。尝试使用COMU进行氨基脲酰化未获成功，归因于COMU在DMF中稳定性不足；改用Oxyma/DIC在室温下实现有效偶联，但空间位阻氨基酸（如Val、Ile）可能需要提高温度或双重偶联。
**3.4 自动化亚单体氮杂肽合成的序列范围**
利用优化后的全流程，研究人员平行合成了系列氮杂三肽，涵盖Phe与Ala的全部位置组合，并引入含有Trt保护基的Asn和Gln残基以验证与酸敏感保护基的兼容性。共快速获得31个氮杂三肽，粗品纯度为21%–71%，纯化后均超过90%。苄溴烷基化较碘甲烷更顺利，后者因沸点低易挥发而降低后期甲基化效率。此外，还合成了两个亮氨酸脑啡肽酰胺衍生物（17和18）及[azaPhe4]-GHRP-6（19）。其中19的粗品纯度和产率与手动合成相当，证实自动化方法与Boc、Trt等酸敏感保护基完全兼容。
**讨论与结论**
该研究成功实现了亚单体氮杂肽合成方法的完全自动化，关键在于使用稳定的异氰酸酯前体替代原位活化，以DMF为统一溶剂并消除冷却步骤，同时借助加热块完成需要升温的反应。自动化方法显著加速了氮杂肽库的制备，一周内可合成超过30个氮杂肽。研究人员指出，扩展的氮杂三肽库在金属结合方面的探索仍在进行中。
