NALCN钠漏通道缺失对多巴胺神经元D2R信号及精神兴奋剂反应性的调控作用

《The Journal of Physiology》：Deletion of the sodium leak channel NALCN in dopamine neurons alters D2R-mediated signalling and psychostimulant responsiveness

　　

中脑多巴胺（DA）神经元是缓慢的起搏细胞，持续发放动作电位，维持靶区域的基础细胞外DA水平。钠漏通道NALCN已被确定为这些神经元起搏控制的关键贡献者。然而，DA起搏活动被破坏的后果在很大程度上仍未被探索。研究人员通过生成在中脑DA神经元中选择性缺失NALCN的小鼠，研究了这种缺失对腹侧被盖区（VTA）DA神经元活动、D2R介导的信号转导、对威胁预测线索的反应性以及雄性和雌性精神兴奋剂反应性的影响。中脑DA神经元中NALCN的选择性缺失削弱了其紧张性活动，但并未降低伏隔核（nucleus accumbens）中的基础细胞外DA水平。DA神经元中NALCN缺失的小鼠未表现出基础运动反应的损伤，对威胁预测线索的反应性和风险评估未改变，而对精神兴奋剂药物的神经化学和行为反应性增强，且DA末端的突触前D2R介导的信号转导发生改变。总之，研究结果强调了NALCN电导在控制DA起搏活动、D2R介导的信号转导以及调节精神兴奋剂运动反应中的重要作用。

论文解读：NALCN在DA神经元起搏活动调控及精神兴奋剂敏感性中的关键作用

一、研究背景与科学问题

多巴胺（dopamine, DA）神经元在编码奖赏预测误差和刺激动机显著性中发挥核心作用，其功能依赖于从缓慢不规则的紧张性放电向快速爆发性放电的转换能力。紧张性放电主要依赖自主起搏活动，由多种离子通道协同调控，包括电压依赖性钙通道、钠通道、A型钾通道和钙激活钾通道（SK通道）。在调控DA神经元内在节律性的多种离子电导中，介导峰间期缓慢阈下去极化的电导被认为对维持其稳健起搏活动至关重要。近期药理学和遗传学研究证实，瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员3（TRPC3）与非选择性钠漏通道NALCN的协同激活支持这一特性。然而，NALCN在DA神经元中缺失导致的起搏活动改变对DA相关行为的影响仍未被探索。基于此，研究人员通过条件性基因敲除策略，系统研究了NALCN在DA神经元中的功能意义。

二、研究内容与主要发现

研究人员通过将Nalcn^loxP/loxP小鼠与Slc6a3-Cre小鼠杂交，生成了DA神经元特异性NALCN敲除小鼠（Nalcn^Slc6a3），并从电生理、神经化学和行为学多个层面进行了系统表征。主要发现如下：

三、关键技术方法

研究采用了多种前沿技术：in vivo juxtacellular记录和ex vivo patch-clamp记录评估DA神经元电生理特性；in vivo微透析结合高效液相色谱（HPLC）检测细胞外DA水平；纤维光度法（fibre photometry）结合GRAB_DA3mDA生物传感器实时监测DA动态；RNAscope荧光in situ杂交检测基因表达；免疫荧光和Western blotting分析蛋白表达水平。行为学测试涵盖运动活动、条件性恐惧、主动回避、高架十字迷宫、热板测试和糖偏好测试等。实验使用3月龄C57BL/6J雄性和雌性小鼠，实验者在对基因型不知情的情况下进行记录。

四、研究结果

1. 中脑DA神经元表达钠漏通道NALCN：通过RNAscopein situ杂交证实，100%的Slc6a3和Th阳性VTA DA神经元表达Nalcn转录本，VTA GABA神经元也含有Nalcn转录本。

2. DA神经元选择性缺失Nalcn改变起搏活动：in vivo记录显示，Nalcn^Slc6a3小鼠中大多数DA神经元处于静息状态，仅记录到1个低频活动的神经元。通过尾部捏夹刺激可唤起静息DA神经元的兴奋性反应。Ex vivo记录证实，敲除小鼠DA神经元自发活动显著降低（平均0.08 Hz vs 0.3 Hz），静息膜电位更超极化（-51 mV vs -46 mV），电流-反应曲线显示兴奋性降低。

3. 纹状体DA信号特征：基础伏隔核（Acb）细胞外DA水平在基因型间无显著差异。DA转运体（DAT）、酪氨酸羟化酶（TH）和囊泡单胺转运体2（VMAT2）表达水平不变，TH磷酸化形式（pS31-TH和pS40-TH）无差异。自发运动活动和探索行为正常。

4. DA末端的D2R介导信号受损：D2R表达水平不变，但D2R激动剂quinpirole降低运动活动的作用在敲除小鼠中减弱。纤维光度法显示，quinpirole诱导的Acb DA瞬变降低幅度在敲除小鼠中显著减小，而eticlopride诱导的DA释放显著减少。eticlopride促进pS40-TH磷酸化的能力在敲除小鼠中缺失。突触后D2R功能（僵住症、FOS和pS10-H3诱导）未受影响。

5. 风险评估和威胁预测线索反应性未受影响：高架十字迷宫测试显示风险评估无差异，热板测试显示伤害感受阈值正常。辨别性听觉威胁条件化和主动回避学习均正常，恐惧消退过程未改变。

6. 甜味奖赏反应未改变：蔗糖与水的偏好、糖精与水的偏好以及蔗糖与糖精的直接比较中，各基因型间均无显著差异。

7. 雄性Nalcn^Slc6a3小鼠对可卡因的运动反应增强：单次可卡因（15 mg/kg）注射后，雄性敲除小鼠的运动活动增强，但细胞外DA增加与对照相似。雌性小鼠无此差异。GBR12783和methylphenidate未完全重现这一效应。D1R、GluA1、DARPP-32和Gαolf表达不变，SKF81297诱导的运动反应无差异。

8. Nalcn^Slc6a3小鼠对d-苯丙胺的精神运动敏化增强：首次d-苯丙胺注射未改变运动反应幅度，但重复暴露后，敲除小鼠（两性）表现出更显著的精神运动敏化，且雌性敲除小鼠的突触DA释放增强。

五、讨论与结论

研究结果表明，NALCN是DA神经元起搏活动的重要调节因子，其缺失导致DA神经元紧张性放电显著降低，但基础细胞外DA水平和基础运动功能得以维持，提示存在代偿机制。NALCN缺失选择性地增强精神兴奋剂的反应性，可能通过改变DA末端的突触前D2R介导信号实现。可卡因诱导的运动反应增强并非由DA释放增加所致，提示下游信号改变可能参与其中。研究揭示了NALCN作为DA神经元内在兴奋性和精神兴奋剂敏感性关键调节因子的重要角色，为理解DA起搏活动失调与精神兴奋剂反应性之间的关系提供了新见解。