《Journal of Genetics and Genomics》：Development and optimization of a cell cycle molecular clock based on the ABE-CRISPR system
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规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）引导的多重诱变已成为谱系追踪的工具；然而，现有系统常表现出无序的突变模式，无法可靠记录细胞分裂历史。为克服这些局限，研究人员开发了腺嘌呤碱基编辑器模板数（ATN）系统，该系统通过可编程的级联修饰实现对双链DNA的有序、
规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）引导的多重诱变已成为谱系追踪的工具；然而，现有系统常表现出无序的突变模式，无法可靠记录细胞分裂历史。为克服这些局限，研究人员开发了腺嘌呤碱基编辑器模板数（ATN）系统，该系统通过可编程的级联修饰实现对双链DNA的有序、逐步编辑。ATN系统逐步标记每个细胞周期，提供增殖事件的定量表示。一旦达到预定分裂次数，系统通过读码框恢复触发下游基因的激活，有效地充当将细胞年龄与诱导性遗传控制相联系的细胞“分子钟”。因此，该方法为研究细胞增殖动力学提供了系统性框架，并能够实现细胞命运的时间调控操作。
细胞分裂是生命体功能、生长和分化的基础，也是生命科学和临床医学关注的核心问题。谱系追踪通过在基因组中累积自然或人工标记来构建分化树，是研究细胞分裂演化轨迹的重要手段。然而，现有基于累积突变的谱系追踪技术虽能解析谱系关系，却难以将谱系锚定到离散的细胞分裂事件上；基于蛋白标记的谱系追踪受分类能力限制，而组学追踪技术成本高昂。因此，研究人员提出需要一种能够直观记录细胞分裂事件并提供过程坐标的系统。规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）引导的多重诱变虽然已用于谱系追踪，但现有系统突变模式混乱，无法可靠记录细胞分裂历史。为克服这些问题，研究人员设计了腺嘌呤碱基编辑器模板数（ATN）系统，这是一种以腺嘌呤碱基编辑器（ABE）为基础的CRISPR多靶点序贯编辑工具。该系统利用ABE靶向含NGG基序的序列，通过编辑产生新的PAM位点，从而循环驱动后续编辑，实现有序、逐步的双链DNA修饰。ATN系统在每个细胞周期逐步标记一次，可定量反映增殖事件，并在达到预定分裂次数后通过读码框恢复触发下游基因表达，起到细胞“分子钟”的作用。该研究将细胞年龄与可诱导的遗传控制相整合，为研究细胞增殖动力学和调控细胞命运提供了系统性框架。
研究采用了多项关键技术。在系统设计上，通过级联PAM生成实现序贯编辑，并设计双sgRNA（即进展sgRNA和表达sgRNA）配合提前终止密码子（PTC）构成分子开关。研究人员利用荧光报告系统与下一代测序（NGS）监测编辑进程，并通过PiggyBac转座子或AAVS1同源重组将ATN整合至真核基因组。为验证细胞周期偶联，采用双胸苷阻断和接触抑制进行周期同步与阻滞，并构建ABE-Geminin（ABEGem）与ABE-Cdt1（ABECdt1）融合编辑器以实现细胞周期选择性表达。研究涉及的细胞系包括HEK293FT、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、小鼠胚胎干细胞（mES）和Neuro-2a（N2A）等商业细胞系。
在结果部分，研究人员首先建立了ATN系统（Establishment of the ATN system）。通过构建ATN-EGFP双sgRNA系统，荧光观察显示未编辑时功能蛋白表达受抑，编辑后出现EGFP信号，证明ATN可作为下游分子开关。NGS数据表明大多数读段呈现从起始位点开始的渐进编辑模式，跳跃编辑极少；ABEmax与ABE8e两种编辑器均可实现有序进展。随后，研究人员将ATN整合至真核基因组并测试其性能（Performance testing of the ATN system located in the eukaryotic genome）。通过PiggyBac转座子整合至293FT细胞基因组后，低重复数的AT2系统在48小时即产生大量荧光信号，高重复数的AT5和AT6系统信号较少，但到96小时均有显著增加。NGS分析显示大部分读段依赖前体位点编辑的有序进展，编辑效率随时间上升并与时间显著相关（P<0.01），跳跃编辑效率也随时间缓慢增加。在严谨性改进方面（Improvements in the rigorousness of the ATN system），研究人员将各spacer的PAM由NGA改为NAA，建立无鸟嘌呤（NoG）系统并选用ABEmax。NGS结果显示，当前体位点未编辑时sgP和sgE均无跳跃编辑；整合至基因组后跳跃编辑极难检测，较未优化系统显著减少。在应用条件优化上（Optimization of application conditions for the ATN system through insertion sites），研究人员通过同源重组将ATN单拷贝整合至AAVS1位点，并提高ABE系统质粒剂量（2×）。与PB转座子插入相比，KI-ATN编辑读段比例更高，进展更稳定有序，位点间梯度更稳定。荧光结果显示AT3#2在96小时出现EGFP阳性克隆，AT4#2在72小时出现。ABE8e在此过程中表现为无序进展和明显跳跃，不适用于ATN进展。在探索ATN与细胞周期的相关性时（Exploring the correlation between ATN and the cell cycle），研究人员比较了含SV40复制起点、无SV40以及两端含绝缘子的质粒，发现自复制质粒编辑效率更高，非自复制质粒编辑效率和进展显著下降。胸苷阻断和接触抑制导致的细胞周期阻滞均显著降低ATN编辑效率和进展。将ABE与Geminin融合（ABEGem）后，细胞增殖受抑时编辑效率显著下降，表明ATN进展与增殖相关。驱动力分析显示，细胞周期同步化细胞中sgP位点间的驱动力分布更均匀有序；sgE的驱动力显著高于sgP，解释了独立sgE编辑现象。ABEmax、ABEGem和ABECdt1三种编辑器均支持有序编辑，但细胞周期阻滞均抑制编辑，证明ATN编辑依赖细胞周期进程。在应用方面（Applications of the ATN system），研究人员在MEF、mES和N2A细胞中均观察到有序编辑；MEF中胸苷阻滞可抑制进展。将ATN引导的Cre系统整合至mTmG MEF Rosa26位点和mCmG 293FT AAVS1位点后，96小时检测到EGFP阳性细胞。将ATN与白喉毒素A（DTA）偶联可诱导Caspase-3阳性的凋亡细胞；流式细胞术检测到的阳性率与sgE位点编辑效率一致。
讨论部分指出，现有谱系追踪技术缺乏纵向坐标，ATN系统作为细胞周期计数器，其进展与细胞周期过程紧密偶联，并在多种细胞类型中通用。但研究也指出，ATN编辑效率受spacer序列影响，极低效率会妨碍远端位点观测；较长循环周期会导致信号衰减；仅提高TadA催化活性（如ABE8e）不足以支持可靠进展。未来需要引入DNA修复引导元件或对ABE进行工程化改造以进一步提升ATN性能。研究结论总结：该研究提出了一种CRISPR引导的多重诱变系统——ATN系统，通过有序、逐步的双链DNA编辑将细胞年龄与可诱导的基因表达整合，作为细胞分子时钟，为研究细胞增殖动力学及调控细胞命运提供了有力工具。在不同DNA复制状态下构建和应用ATN系统，能够精确监测细胞分裂过程并进行调控。
