《Journal of Hazardous Materials Advances》：Toxicological effects of micro- and nanoplastic exposure reveal resistance mechanisms to programmed cell death in hepatic cells
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微塑料（microplastics, MPs）损害HepG2细胞的内在凋亡（intrinsic apoptotic pathway）通路。聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate, PET）和聚乙烯（polyethylene,
微塑料（microplastics, MPs）损害HepG2细胞的内在凋亡（intrinsic apoptotic pathway）通路。聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate, PET）和聚乙烯（polyethylene, PE）上调HepG2细胞中的抗凋亡蛋白。PET和PE下调HepG2细胞中的促凋亡标志物。微塑料影响Bcl-2磷酸化（phosphorylation）和定位（localization）。微塑料增加HepG2细胞对多柔比星（doxorubicin, DOX）的耐药性。
论文解读：微塑料和纳米塑料暴露揭示肝细胞程序性细胞死亡抵抗机制
研究背景方面，塑料制品因低成本、便利性和持久性而广泛存在，过去五十年塑料产量大幅增加。环境中尺寸为5 mm至1 μm的人工聚合物被称为微塑料（microplastics, MPs），而更小尺度的纳米塑料（nanoplastics, NPs）也受到关注。MPs可分为初级MPs和次级MPs，后者由塑料碎片经微生物、动物和物理活动裂解形成。MPs已在海洋生物、水果蔬菜、糖、海产品、瓶装水和牛奶中被发现，并进入食物网，经口途径导致人类暴露。MPs还可通过摄入、吸入和皮肤接触进入人体，并已在人类血液和胎盘中被鉴定。进入循环系统后，MPs可与人类细胞相互作用，引起基因毒性、凋亡、氧化应激、纤维化、癌变和炎症反应等细胞效应。肝是人体主要解毒器官和关键代谢器官，负责外源物代谢和清除，因此肝细胞培养模型对评价污染物对人类健康的影响具有价值。HepG2细胞具有功能性酶，可执行外源物代谢，被视为类似正常肝细胞。然而，MPs对人类肝细胞的影响仍有限。因此，研究人员旨在探究PE和PET对HepG2细胞的细胞毒性作用，并通过评估凋亡通路相关蛋白表达阐明相关机制。
研究人员开展的研究中，选用HepG2人肝细胞癌细胞，使用来自无色水瓶的PE和PET颗粒，包括PET1（<1 μm）、PET2（<2.6 μm）和PE（<2.6 μm），处理72 h后，通过凋亡标志物、内在凋亡通路蛋白、Bcl-2定位、增殖、多柔比星耐药和锚定非依赖生长等分析，得出结论：MPs/NPs暴露可抑制HepG2细胞凋亡，上调抗凋亡蛋白，下调促凋亡蛋白，改变Bcl-2和Bax定位，并增加对多柔比星的耐药性及锚定非依赖生长能力。这些发现提示MPs/NPs可能促进更具侵袭性、凋亡抵抗和潜在致瘤性的肝癌细胞表型，对肝细胞癌进展具有重要警示意义。
关键技术方法概述如下：HepG2人肝细胞癌细胞来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。PET和PE颗粒由无色水瓶经液氮低温断裂、球磨和过滤制备，PET1（<1 μm）、PET2（<2.6 μm）、PE（<2.6 μm）；傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认聚合物组成，扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDX）观察形态和元素，按聚合物密度估算浓度并高压灭菌。细胞处理72 h。主要方法包括Annexin V-FITC/7-AAD流式细胞术、TUNEL、Western blot（WB）、免疫荧光/共聚焦显微镜、CCK-8增殖及多柔比星（DOX）抵抗、软琼脂集落形成，统计采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验。无人体样本队列。
研究结果如下。
3.1 Effect of micro- and nanoplastics on apoptosis in HepG2 cells（微塑料和纳米塑料对HepG2细胞凋亡的影响）
3.1.1 Revelation of apoptosis by cellular markers（通过细胞标志物揭示凋亡）
通过Annexin V流式细胞术分析，结果显示MPs/NPs在所有分析条件下均能抑制凋亡。TUNEL实验进一步支持该结果：未处理HepG2细胞中存在分散的凋亡细胞，而PET和PE处理减少凋亡细胞数量。与对照相比，PET 1 μm处理组凋亡细胞百分比降低（p<0.01），PET 2.6 μm和PE 2.6 μm处理组也降低（p<0.05）。
3.1.2 Intrinsic apoptosis pathway: Protein analysis by Western Blot and Immunofluorescence（内在凋亡通路：Western Blot和免疫荧光蛋白分析）
通过WB分析，Bax蛋白水平在所有分析条件中降低，PET（p<0.05）和PE（p<0.001）显著；Bcl-2在所有MPs/NPs类型中过表达；Bax/Bcl-2比值在PET和PE处理细胞中显著降低（p<0.001）。Caspase-3仅在PET 1 μm处理的HepG2中降低，PET 2.6 μm和PE 2.6 μm与对照相比无显著差异。抗凋亡蛋白MCL-1在PET处理细胞中较对照高表达（p<0.001），支持凋亡减少。免疫荧光分析显示，Bcl-2在PET 1 μm（p<0.001）、PET 2.6 μm和PE 2.6 μm（p<0.01）处理细胞中过表达；Bax在PET 1 μm（p<0.001）、PET 2.6 μm和PE 2.6 μm（p<0.01）处理细胞中降低；Bax/Bcl-2比值降低与WB一致。Caspase-3蛋白水平在两种PET处理中降低（p<0.05）。Bcl-xL在PET 2.6 μm（p<0.001）和PE 2.6 μm（p<0.05）处理中表达增加，PET 1 μm无显著差异，且PET 2.6 μm中Bcl-xL表达较PET 1 μm更明显（p<0.05）。Bcl-w在所有分析条件中表达增加（p<0.01）。MCL-1在PET 1 μm（p<0.001）和PET 2.6 μm（p<0.05）中过表达，PE 2.6 μm无显著差异。促凋亡蛋白Bad在所有MPs/NPs类型中低表达（p<0.001）；NOXA在PET 1 μm（p<0.05）和PET 2.6 μm（p<0.001）处理中降低。细胞色素c荧光强度在PET 1 μm（p<0.05）和PE 2.6 μm（p<0.001）处理细胞中降低，PET 2.6 μm无显著差异。
3.1.3 Phosphorylation of Bcl-2（Bcl-2磷酸化）
通过共聚焦显微镜评估Bcl-2亚细胞定位，结果显示与对照相比，所有MPs/NPs处理的HepG2细胞中Bcl-2定位于核区。讨论进一步指出，PET和PE诱导Bcl-2磷酸化，而Bcl-2作为重要抗凋亡蛋白，其磷酸化可能参与调节细胞增殖、肿瘤发生和化疗耐药。
3.2 Assessment of Tumorigenicity and Doxorubicin Resistance in HepG2 Cells Exposed to Microplastics（微塑料暴露HepG2细胞的致瘤性和多柔比星耐药性评估）
将HepG2细胞用PET1、PET2.6和PE2.6处理72 h，并在有或无多柔比星（DOX）条件下评估耐药性。CCK-8细胞生长分析显示，所有MPs/NPs处理组较对照增殖增加，其中PE暴露增加最明显，PET1和PET2.6呈中度但显著增加。DOX处理后，MPs/NPs暴露细胞对DOX敏感性降低；PE处理细胞对DOX诱导的生长抑制抵抗最高，其次为PET2.6和PET1；对照DOX组如预期增殖显著降低。软琼脂实验进一步证实，MPs/NPs暴露增强HepG2细胞锚定非依赖生长能力，这是细胞转化和致瘤潜能的指标；PE处理细胞生长最强，其次为PET2.6和PET1。这些结果提示MPs/NPs暴露破坏正常凋亡机制，并促进对多柔比星等细胞毒性治疗的抵抗。
讨论部分总结：MPs是重要环境污染物，对健康有不利影响。它们在食品和饮用水中广泛存在，但生物学影响数据仍有限。肝作为外源物代谢和解毒关键器官，尤其易受MPs累积影响。凋亡在维持细胞生长与分裂平衡、防止失控癌症中具有基础作用。研究人员使用PET和PE两种MPs/NPs及1 μm和2.6 μm两种尺寸处理HepG2细胞，发现MPs/NPs显著抑制凋亡。该结果与部分既往研究相反，因此促使研究人员研究内在凋亡通路。Bax/Bcl-2比值是评价凋亡率的分子指标；本研究中Bcl-2升高、Bax降低、Bax/Bcl-2比值降低。Caspase-3属于蛋白酶家族，在凋亡起始和进展中关键；PET处理降低caspase-3，而PE未降低。研究人员首次显示PET和PE诱导Bcl-2磷酸化，提示MPs/NPs可能参与HepG2细胞对程序性细胞死亡的抵抗机制，并与Bcl-2磷酸化调节细胞增殖、肿瘤发生和化疗耐药的研究一致。免疫荧光分析还提示MPs/NPs不仅调节蛋白表达，也影响细胞内定位，可能改变凋亡信号通路。抗凋亡蛋白Bcl-w、Bcl-xL和MCL-1分析显示，Bcl-xL在PET2.6和PE2.6处理后升高，Bcl-w在所有条件中过表达，MCL-1在PET处理HepG2中升高。促凋亡蛋白Bad和NOXA在MPs/NPs处理HepG2中下调，细胞色素c在PET1和PE2.6处理细胞中低表达，提示细胞更持久并逃逸凋亡。结合研究人员团队先前报道的自噬激活，微塑料暴露可能通过自噬介导的生存反应抑制凋亡，使应激细胞持续存在；若长期维持，可能损害受损肝细胞清除并促进异常细胞积累，但需体内研究确认。观察到的凋亡抑制促使研究人员进一步研究DOX反应，结果发现MPs/NPs处理细胞增殖增加，PE最明显，PET1和PET2.6次之；DOX处理后MPs/NPs暴露细胞敏感性降低，PE抵抗最高，PET2.6和PET1次之，而对照DOX组增殖显著降低。软琼脂实验显示MPs/NPs增强锚定非依赖生长，PE最强，PET2.6和PET1次之，支持MPs/NPs促进更具侵袭性、凋亡抵抗表型。DOX抵抗可能与Bcl-2及其磷酸化状态调节有关。研究人员提出假说模型，认为MPs/NPs（PET1、PET2.6和PE）不诱导经典凋亡，而促进细胞死亡抵抗，这可能与潜在致瘤特征相关，提示细胞行为向更具侵袭性表型转变。研究局限是实验仅使用HepG2肝细胞癌细胞系，限制普适性；需使用其他HCC细胞系如Huh-7、Hep3B、MHCC97H和SNU-449进一步研究。
研究结论翻译：研究人员的研究提供了新证据，表明微塑料和纳米塑料暴露通过调节关键凋亡调节因子破坏HepG2细胞凋亡。观察到的凋亡减少与Bcl-2表达增加、Bax/Bcl-2比值降低、caspase-3下调（在PET处理细胞中）以及Bcl-2和Bax的细胞内定位改变相关。此外，Bcl-2磷酸化提示MP/NP暴露与肝癌细胞化疗耐药机制之间存在潜在联系。而且，研究人员证明，MP/NP处理的HepG2细胞对多柔比星表现出增加的耐药性，进一步支持MPs/NPs可能促进更具侵袭性的癌症表型这一观点。MP/NP暴露细胞在锚定非依赖方式下生长能力增加，突出了MPs/NPs的潜在致瘤效应，引发对其在肝细胞癌进展中作用的担忧。这些发现为越来越多的证据作出贡献，即MPs/NPs干扰正常细胞过程，可能促进肿瘤发生和凋亡抵抗。鉴于MPs/NPs在环境中广泛存在，需要进一步研究其长期效应，尤其是在体内模型中。此外，有必要使用其他HCC细胞系开展研究，以确定所观察到的效应是HepG2细胞特异性的，还是更广泛适用于HCC，并进一步制定策略以减轻其对人类健康的潜在影响。
