混合菌固态发酵多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的时序代谢组学与生物活性动态：36–48 h 品质窗口及代谢重塑

《Journal of Food Composition and Analysis》：Time-Course Metabolomics and Bioactive Dynamics of Polygonatum cyrtonema Hua during Mixed-Strain Solid-State Fermentation

　　

混合菌固态发酵（mixed-strain solid-state fermentation）提升了多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua，PCH）的功能品质。研究人员确定了 36–48 h 的有利品质期。胞外水解酶（extracellular hydrolases）与生物活性成分（bioactive constituents）转化相关。时间分辨代谢组学（time-resolved metabolomics）揭示 36 h 是关键代谢转变点。发酵驱动的 PCH 生物转化（biotransformation）涉及代谢重塑（metabolic remodeling）。

研究背景方面，多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua，PCH）为百合科? 原文 Asparagaceae，药食同源多年生药用与食用植物，其干燥根茎是传统药食同源资源。市场上药用黄精来源于 PCH、Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. 和 Polygonatum sibiricum Red 三个原物种。黄精含多糖、甾体皂苷、多酚类化合物和生物碱等生物活性成分，传统中医认为其具有补气、养阴、润肺、健脾、补肾等作用，现代药理研究显示其具有抗衰老、抗肥胖和抗肿瘤等作用，并已加工为草本饮料、复合酒和营养配料等高值功能产品。然而，生黄精存在舌麻、喉部刺激等不良感官特征，限制其直接用于功能食品开发。传统九蒸九晒可改善感官可接受性和功能性质，但耗时、费力和高能耗，规模化受限，且反复蒸晒可能导致多糖降解，影响加工产品营养价值。固态发酵（solid-state fermentation，SSF）因操作简单、环境友好和成本效益高而成为有前景的生物技术，微生物分泌多种胞外酶催化大分子降解与转化，产生可溶性糖、氨基酸、有机酸和其他生物活性代谢物。混合菌体系较单菌体系可通过协同产酶和代谢互作提供互补代谢能力，促进更复杂的生物转化。以往黄精发酵研究多集中于单菌体系、发酵联合蒸制预处理或终点质量评价。因此，研究人员采用 Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum）和 Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）混合菌固态发酵 PCH，整合理化分析、酶活测定和非靶向代谢组学，系统分析发酵期间生物活性成分和代谢通路的动态变化，旨在确定与优良整体品质相关的有利发酵窗口，并为发酵黄精功能食品开发和优化提供理论依据。

关键技术方法概览不超过250字：采用 L. plantarum（ACCC 11095）和 S. cerevisiae（ATCC 9763）进行混合菌固态发酵，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，CICC 21253）仅用于初步筛选。PCH 根茎来自湖南药用植物种质资源园（长沙，中国），切片 2–3 mm，50℃干燥，过 80 目筛。粉末与无菌蒸馏水按 1:1.25（g:mL）混合，pH 调至 6.0±0.1，混合菌按初始活菌比 2:1 制备，总活菌密度约 10⁸ CFU mL^?1，按 2%（v/w）接种，37℃发酵 60 h，于 0、12、24、36、48 和 60 h 采样。测定色差、总多糖、总黄酮、总皂苷、总生物碱、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC，FRAP 法）、糖苷酶和脂肪酶活性，并进行超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）非靶向代谢组学分析，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）、变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）、倍数变化（fold change，FC）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

研究结果按原小标题总结如下。3.1 色度参数、生物活性成分和抗氧化能力的动态变化：随发酵进行，PCH 颜色由黄棕逐渐变为深棕，ΔE 持续升高，L* 下降，a* 和 b* 升高，提示外观变化及潜在内部生化转化。总多糖逐渐增加，48 h 达 22.40 mg/g，较未发酵 PCH 高 72.3%。总黄酮在 36–48 h 维持较高且较稳定水平（0.45–0.48 mg/g），较初始样品增加 32–41%。总皂苷增加最明显，36 h 达 19.74 mg/g，较未发酵对照高 242.7%，且 36–48 h 无显著差异。总生物碱前 24 h 相对稳定，36 h 后显著下降。T-AOC 与多糖、黄酮和皂苷变化相似，48 h 最高后下降；相关分析显示 T-AOC 与多糖、黄酮和皂苷高度正相关，与生物碱负相关。研究人员据此认为，36–48 h 在本文条件下为有利发酵窗口。讨论指出，早期胞外酶可降解细胞壁并水解释放可溶性多糖、黄酮和皂苷衍生物，后期营养可利用性下降和微生物代谢改变可能加速释放化合物的消耗或转化；发酵中氧化酶也可能促进黄酮类转化。水分含量和水分活度未监测，限制其潜在影响评估；延长发酵并未持续改善所有评价属性，因此该窗口并非普适最优发酵时长。

3.2 PCH 固态发酵过程中糖苷酶和脂肪酶活性的时间变化：两种酶活性总体均随发酵增加。脂肪酶活性在 48 h 达峰后下降；糖苷酶活性在 36 h 升至较高水平并持续相对稳定至 60 h。L. plantarum 和 S. cerevisiae 均可产生 β-葡萄糖苷酶，该酶参与糖苷键水解及植物基质中苷元或其他低分子化合物的释放。脂肪酶可能参与底物脂质水解，生成游离脂肪酸并促进风味相关代谢反应。糖苷酶和脂肪酶活性曲线与生物活性成分的时间趋势相似，提示酶过程可能参与发酵期间成分变化，但这些相似趋势不能建立因果关系，仍需进一步研究特定贡献。

3.3 非靶向代谢组学揭示 PCH 发酵期间动态代谢重塑。3.3.1 代谢组学概览：共保留 1,851 个注释代谢特征，其中氨基酸及衍生物 370 个、含糖等其他类别 284 个、有机酸 277 个、苯及取代衍生物 196 个、生物碱 138 个、醇和胺 122 个、酚酸 106 个，均占注释代谢特征 5%以上。PCA 中 PC1 和 PC2 分别解释 17.68%和 7.36%，累计 25.04%，作为探索性可视化；QC 样本紧密聚集，表明分析稳定性与重复性较好。OPLS-DA 得 R²X=0.242、R²Y=0.995、Q²=0.879，200 次置换无模型超过原模型，但因生物学重复有限，该模型用于支持多变量差异可视化，而非建立预测普适性。

3.3.2 差异代谢物分析揭示阶段特异性代谢改变：以 VIP>1 且 FC≥2 或≤0.5 筛选，0 h vs 12 h、12 h vs 24 h、24 h vs 36 h、36 h vs 48 h、48 h vs 60 h 分别有 77、44、58、38 和 44 个差异累积代谢物（differentially accumulated metabolites，DAMs）。36–48 h 比较的候选 DAMs 最少且以下调为主，支持该时期代谢谱相对稳定，并与成分和抗氧化结果共同支持 36–48 h 为有利窗口。热图显示，糖类相关差异特征 20 个，蔗糖、海藻糖、棉子糖、龙胆三糖和 lychnose 等在未发酵 PCH 中丰度较高，发酵中逐渐下降，符合可快速利用碳水化合物的水解和/或微生物利用；36–48 h 赤藓醇、半乳糖醇、甘露醇等醛醇和庚糖显著增加。黄酮相关代谢物多数较未发酵对照增加，可能与微生物酶介导的植物基质转化、结合态酚类和黄酮衍生物释放有关。生物碱相关代谢物呈两种趋势：14 个特征在未发酵和早期发酵样品中丰富，36 h 后显著下降，如 tetrahydropapaveroline、harmine、perlolyrine、salsolidine 等；同时检测到四氢异喹啉相关和喹啉相关含氮代谢物，部分此类化合物曾有神经活性或潜在毒理学效应报道，其在发酵 PCH 中的作用需进一步毒理评价。另 23 个生物碱相关代谢物如 carmicheline、indole-3-glycol aldehyde 在 36 h 后增加，表明含氮次生代谢活跃重塑。由于非靶向代谢组学提供推定注释和相对丰度，仍需靶向确认、定量及安全性评估。

3.3.3 KEGG 富集分析揭示 PCH 生物转化关键代谢通路：基于酶活、生物活性成分和整体代谢谱的协同变化，24–36 h 被确定为关键代谢阶段。该阶段候选 DAMs 主要映射到碳水化合物代谢（氨基糖和核苷酸糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸互变、抗坏血酸和醛酸代谢、核苷酸糖生物合成）、氨基酸代谢（苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、D-氨基酸代谢）、次生代谢（benzoxazinoid biosynthesis、tropane、piperidine、pyridine 生物碱生物合成）和转运系统（ABC transporters）。7 个代表 DAMs 包括 phenylacetylglycine、3-hydroxycinnamic acid、3-hydroxyindolin-2-one、L-arabinose、4-trimethylammoniobutanoate、hyoscyamine 和 N-acetyl-D-phenylalanine。L-阿拉伯糖增加与多糖降解及较小碳水化合物释放一致；核苷酸糖生物合成可能支持微生物胞外多糖合成与适应。3-羟基肉桂酸增加与芳香前体代谢变化一致，并可能与酚酸、黄酮相关代谢物变化有关；发酵中 L* 下降和 ΔE 增加提示 PCH 逐步变暗，可能与酚类转化和有色衍生物生成有关。phenylacetylglycine 和 N-acetyl-D-phenylalanine 增加进一步提示芳香氨基酸代谢物的活跃微生物转化。含氮次生代谢也发生显著重塑，hyoscyamine 在 36 h 增加提示含氮次生代谢动态重塑而非简单积累或耗竭。ABC 转运蛋白为 ATP 依赖膜系统，参与糖、氨基酸等代谢物摄取和交换，多个差异代谢物映射至该通路，仍需靶向功能验证。

讨论与结论总结：讨论部分强调，发酵结果依赖底物特征、微生物组成和加工条件，单个属性改善未必同时发生；本研究未监测水分含量和水分活度，限制评估其潜在影响；酶活与成分趋势相似不能建立因果关系；代谢物注释为推定，含氮代谢物用于食品应用时需关注总生物碱和相关含氮代谢物变化，并进行靶向确认、定量和安全性评估；缺乏匹配单菌对照，限制评估 L. plantarum 和 S. cerevisiae 各自贡献及潜在相互作用，且未监测时间分辨微生物和理化参数。研究意义在于，发酵通过生化转化和代谢重塑提高 PCH 中某些生物活性成分水平，并确定 36–48 h 为本文条件下有利于生物活性成分积累的发酵窗口，为理解微生物介导 PCH 转化及发酵黄精功能食品开发提供依据。研究结论翻译：本研究系统分析了 L. plantarum 和 S. cerevisiae 混合菌固态发酵过程中 PCH 的生物活性成分、胞外酶活性和代谢组学谱的动态变化。糖苷酶和脂肪酶活性与多糖、黄酮和皂苷含量呈现相似时间趋势。这些生物活性成分与 T-AOC 正相关，并在 36–48 h 发酵期内达到相对较高水平。时间分辨代谢组学表明，糖类、黄酮类和生物碱相关特征的相对丰度存在明显时间变异。探索性 KEGG 分析将若干候选 DAMs 与碳水化合物代谢、苯丙氨酸代谢、含氮次生代谢和 ABC 转运蛋白相关通路注释相关联。应承认若干局限：缺乏匹配单菌对照限制评估 L. plantarum 和 S. cerevisiae 的各自贡献及潜在相互作用；此外，发酵过程中未监测时间分辨微生物和理化参数。未来研究需纳入单菌对照和过程监测，以更好表征菌株贡献和发酵动力学。总体而言，发酵通过生化转化和代谢重塑提高了 PCH 中某些生物活性成分水平。在本研究条件下，36–48 h 被确定为有利于生物活性成分积累的发酵窗口。本研究获得的代谢组学见解有助于更深入理解微生物介导的 PCH 转化，并支持发酵黄精功能食品开发。