德国苹果酒（Apfelwein）中挥发性与非挥发性酚类化合物的联合RP-UHPLC-DAD-FLD、HILIC-FLD及(TIMS)-QTOF-HR-MS/MS表征研究

《Journal of Food Composition and Analysis》：Characterization of volatile and non-volatile phenolic compounds in German ciders (type ‘Apfelwein’) by a combined RP-UHPLC-DAD-FLD, HILIC-FLD, and (TIMS)-QTOF-HR-MS/MS approach

苹果酒（Cider）是欧洲广泛消费的酒精饮料，其特性因国家而异。其质量受多种因素影响，包括风味相关化合物（挥发性物质）以及糖酸比。此外，苹果品种、果实成熟度、发酵条件及后续加工和储存条件的不同也会导致其酚类化合物组成和感官特性的差异。酚类化合物是决定苹果酒品质的关键因素之一，显著影响苦味、涩感和色泽等感官属性。苦味和涩感的感知被认为与花青素原（proanthocyanidins）的聚合度（degree of polymerization, DP）密切相关。研究表明，苦味主要与低聚原花青素相关，而涩感随分子量增大而增强。除不挥发性酚类化合物外，挥发性酚类（如乙烯基酚和乙基酚）在决定苹果酒品质方面也起着至关重要的作用，其中4-乙基儿茶酚（4-ethylcatechol）已被确定为法国苹果酒酚类缺陷的关键标志化合物。鉴于这些化合物对苹果酒感官品质的重要性，对其进行准确定量至关重要。以往基于液相色谱（LC）的苹果酒研究主要针对不挥发性酚类化合物，而挥发性酚类通常采用气相色谱（GC）法单独分析。尽管有研究展示了基于LC的挥发性酚类测定方法，但其方法并未涵盖苹果酒中更广泛的不挥发性酚类化合物。因此，本研究旨在开发一种新型的RP-UHPLC-DAD-FLD方法，实现对挥发性酚类（乙烯基酚和乙基酚）、其前体（羟基肉桂酸）以及黄烷-3-醇（flavan-3-ols）、二氢查尔酮（dihydrochalcones）和黄酮醇（flavonols）等相关类别酚类化合物的同步分析。此外，本研究还旨在提供德国苹果酒酚类化合物谱的最新概览。研究人员采用该方法并结合亲水相互作用液相色谱（HILIC）及离子迁移谱-四极杆-飞行时间高分辨质谱（TIMS-QTOF-HR-MS/MS）技术，对38款德国商业苹果酒（来自13家生产商）进行了分析，共鉴定出33种酚类化合物。结果显示，总酚类化合物含量平均为105.8 ± 54.8 mg/L，其中黄烷-3-醇（聚合度DP 1–7）为主要类别（平均54.0 mg/L），其次为羟基肉桂酸（23.7 mg/L）和二氢查尔酮（23.1 mg/L）。挥发性酚类中，4-乙基儿茶酚含量最高（平均1.4 mg/L）。感官接受度与酚类谱的相关性分析表明，部分酚类化合物（如某些低聚原花青素和4-乙基愈创木酚）与消费者接受度存在关联，而高聚合度原花青素及某些乙基酚类可能与较低的接受度相关。该研究首次系统报道了德国苹果酒中挥发性酚类的LC-MS数据，并建立了一种可同时分析多种酚类化合物的高效方法，为苹果酒品质控制和品种鉴别提供了新的技术手段。

研究背景与目的

苹果酒是欧洲广泛消费的酒精饮料，其品质受原料品种、成熟度、发酵条件及加工储存等多种因素影响。酚类化合物是决定苹果酒感官品质的关键因素，显著影响苦味、涩感和色泽等属性。已有研究证实，苦味主要与低聚原花青素（procyanidins）相关，而涩感随分子量增大而增强。此外，挥发性酚类（如4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚等）对苹果酒香气特征具有重要贡献，其中4-乙基儿茶酚（4-ethylcatechol）已被确认为法国苹果酒酚类缺陷的关键标志物。然而，以往基于液相色谱（LC）的研究主要集中于不挥发性酚类，挥发性酚类通常采用气相色谱（GC）单独分析，缺乏能够同时覆盖两类化合物的高效方法。针对这一技术空白，本研究旨在开发一种新型反相超高效液相色谱-二极管阵列-荧光检测（RP-UHPLC-DAD-FLD）方法，实现对挥发性酚类及其前体羟基肉桂酸、黄烷-3-醇、二氢查尔酮和黄酮醇等化合物的同步定量分析，并系统表征德国苹果酒的酚类化合物谱。

研究内容与结论

研究人员基于38款德国商业苹果酒（来自13家生产商，含28款澄清型和10款天然浑浊型，其中6款标注为“Speierling”），结合RP-UHPLC-DAD-FLD、亲水相互作用液相色谱-荧光检测（HILIC-FLD）及离子迁移谱-四极杆-飞行时间高分辨质谱（TIMS-QTOF-HR-MS/MS）技术，共鉴定出33种酚类化合物，其中25种经标准品验证。化合物类别涵盖13种羟基肉桂酸及其衍生物、5种黄烷-3-醇、4种黄酮醇糖苷、5种二氢查尔酮、3种乙烯基酚和3种乙基酚。通过HILIC分析，研究人员进一步检测到聚合度（DP）为3至7的黄烷-3-醇低聚体。

定量结果表明，总酚类化合物含量平均为105.8 ± 54.8 mg/L（范围28.4–314.3 mg/L）。黄烷-3-醇（DP 1–7）为主要类别，平均含量54.0 mg/L，约占总酚的50%，其中DP3和DP4低聚体贡献最大（分别平均13.9和14.9 mg/L）。羟基肉桂酸（23.7 mg/L）和二氢查尔酮（23.1 mg/L）各占约22%，其中5-O-咖啡酰奎宁酸（9.9 mg/L）、咖啡酸（5.0 mg/L）、根皮苷-2′-O-木糖葡萄糖苷（10.4 mg/L）和根皮苷（9.6 mg/L）为主要成分。黄酮醇（2.2 mg/L）和挥发性酚类含量较低，其中4-乙基儿茶酚平均含量最高（1.4 mg/L），其次为4-乙基苯酚（0.4 mg/L）。值得注意的是，4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸和羟基根皮素戊糖己糖苷在所有38款样品中均被检出，可作为苹果酒潜在鉴别标志物。

感官相关性分析

研究人员将38款苹果酒的感官接受度测试结果与酚类化合物谱进行相关性分析。结果表明，部分酚类化合物与消费者接受度存在显著关联：某些低聚合度原花青素（如DP3、DP4）和4-乙基愈创木酚与较高接受度相关，而高聚合度原花青素（DP6、DP7）及部分乙基酚类（如4-乙基儿茶酚、4-乙基苯酚）与较低接受度相关。这些发现为理解酚类组成对苹果酒感官品质的影响提供了直接证据。

技术方法概述

本研究采用的关键技术方法包括：1）RP-UHPLC-DAD-FLD方法，用于同步定量挥发性酚类、羟基肉桂酸、黄烷-3-醇单体及二聚体、二氢查尔酮和黄酮醇；2）HILIC-FLD方法，用于分离和定量聚合度DP 3–7的黄烷-3-醇低聚体；3）TIMS-QTOF-HR-MS/MS技术，用于化合物的结构鉴定，提供精确质量数和碰撞截面积（CCS）作为额外分子描述符；4）主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归（PLS）用于数据分析及标志物筛选；5）感官接受度测试（由未受训参与者完成）与酚类数据的相关性分析。

讨论与结论

本研究首次系统报道了德国苹果酒中挥发性酚类的液相色谱-质谱数据，并建立了一种可同时分析挥发性与不挥发性酚类化合物的高效方法。与文献报道的法国、英国、西班牙及芬兰苹果酒相比，德国苹果酒的总酚含量处于较低至中等水平，这与使用餐后苹果品种（dessert apple cultivars）的原料特征一致。研究还发现，不同生产商的苹果酒在酚类组成上存在显著差异，这可能与原料品种、成熟度、加工条件（如多酚氧化酶活性及热处理）和发酵菌种等因素有关。感官相关性分析揭示了酚类组成与消费者接受度之间的潜在联系，为苹果酒生产商优化产品品质提供了科学依据。此外，4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸和羟基根皮素戊糖己糖苷在所有样品中的稳定检出，提示这些化合物可能作为苹果酒真伪鉴别的潜在标志物。总体而言，本研究不仅填补了德国苹果酒挥发性酚类数据空白，还为苹果酒酚类分析提供了一种高效、全面的技术方案，对苹果酒品质控制和品种鉴别具有重要应用价值。