亚洲社区污水处理厂抗生素抗性基因削减效能及其分布特征研究

《BioTechniques》：Removal of antibiotic resistance genes in wastewater treatment plants and their distribution in selected Asian communities

　　

本研究评估了一座采用传统活性污泥法（CAS）的污水处理厂（WWTP）对特定抗生素抗性基因（ARGs）的削减效果，并考察了所选亚洲社区中ARGs的分布情况。A组样本（n=21）于2020年5月至7月期间，每周采集自日本某WWTP的进水、二级处理出水和最终出水阶段；B组样本（n=40）于2022年至2023年间采集自日本、菲律宾、越南和泰国。研究人员采用基于Biomark HD系统的高通量定量聚合酶链反应（HT-qPCR）对样本进行分析，检测目标包括粪便指示菌、移动遗传元件（MGE）和ARGs。在A组样本中，除万古霉素耐药基因（vanA）外，所有目标ARGs和I类整合子整合酶基因（int1）均被检出。出水中仍残留大量ARGs。日本和泰国样本呈现的ARG谱型更接近于社区相关耐药性，而越南和菲律宾样本的谱型则可能受到医疗机构相关来源的影响。为管理抗菌药物耐药性的环境传播，有必要改进处理工艺并制定针对性的监测策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球重大公共卫生威胁，被世界卫生组织列为全球健康十大威胁之一。污水处理厂（WWTP）汇集了来自各种来源的耐药菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs），成为ARGs传播和水平基因转移（HGT）的热点区域。然而，WWTP并非为高效去除ARGs而设计。高收入国家的集中式WWTP通常采用传统活性污泥法（CAS）作为主要处理工艺，但CAS系统对ARGs的去除效率有限，且臭氧、紫外线等高级氧化工艺虽能有效灭活耐药菌，但其广泛应用往往成本高昂。

目前，已知的ARGs种类繁多，对所有基因进行全面监测既耗时又昂贵，因此识别能够反映WWTP中ARGs存在与灭活情况的过程指示物具有重要意义。此前研究提出pBI143（一种在肠道微生物组中高度丰富的隐蔽性质粒，较新的人类粪便标记物）作为追踪WWTP中ARGs命运的有效过程指示物，其效果优于HF183（人源拟杆菌目粪便标记物）和crAssphage（人类肠道相关噬菌体）。

此外，亚洲地区AMR负担严峻。东南亚国家如泰国、菲律宾和越南，由于经济快速发展和人口增长，动物蛋白需求增加，导致动物源抗菌药物使用量（AMU）超过人类。越南是全球第三大水产品生产国，其水产养殖业高度依赖抗菌药物。相比之下，日本实行更严格的抗菌药物管理政策和完善的卫生系统，但通过食品进口和大量人员流动与东南亚国家紧密联系，存在AMR跨境传播的潜在途径。然而，这些国家间废水ARG谱型的系统性比较研究仍然有限。

因此，本研究旨在：（a）评估CAS系统WWTP对特定ARGs、移动遗传元件（MGE）和粪便标记物的去除效率；（b）应用高通量定量PCR（HT-qPCR）同时定量废水中这些目标；（c）评估粪便指示物和MGE作为ARG过程指示物的潜力；（d）表征所选亚洲社区中ARGs和MGE的分布特征。

二、主要技术方法

研究人员采用高通量定量PCR（HT-qPCR）技术，在Biomark HD系统上使用96.96和48.48 Dynamic Array IFC芯片，对A组和B组样本进行多重目标基因的同步定量检测。目标检测包括：粪便指示菌——大肠杆菌（sfmD）；总细菌——16S rRNA基因；ARGs——bla_AmpC、bla_CTX-M、bla_NDM-1、bla_TEM、mcr-1、mecA、sul1、tetB和vanA；MGE——int1；人类粪便指示物——pBI143、crAssphage、gyrB和HF183-TaqMan。样本采集方面，A组21份样本采集自日本山梨县甲府市某集中式WWTP的进水、二级处理出水和最终出水三个处理阶段，每周采集一次，持续7周（2020年5月至7月）。B组40份样本分别采集自日本甲府（12份进水，2022年8月至2023年7月）、菲律宾马尼拉（8份运河水，2022年7月至2023年2月）、泰国曼谷（10份进水）和越南河内（10份河水，2021年12月至2022年9月）。样本前处理方面，A组采用膜过滤法，B组采用离心浓缩法。所有样本经DNA/RNA提取和逆转录后，进行特异性靶标扩增（STA）预扩增，再行HT-qPCR检测。

三、研究结果

3.1 HT-qPCR检测性能

HT-qPCR检测的R2值范围为0.97±0.028至1.00，扩增效率为88.4±24.9%至121.9±51.3%，表明该方法在多种废水基质中同时检测ARGs、MGE、总细菌和粪便指示物具有整体可靠的性能，与此前HT-qPCR监测研究结果一致。

3.2 A组样本中ARGs和MGE的存在与去除

进水中除bla_NDM-1外，ARGs和MGE检出率为100%。bla_NDM-1在2020年进水样本中检出率为57%，而2023年同厂样本检出率升至94%，表明该汇水区域内碳青霉烯耐药性快速上升。二级处理出水和最终出水中，除bla_NDM-1、mcr-1和mecA外，所有目标ARGs和MGE均被检出。vanA在所有样本中均未检出，提示研究汇水区域内万古霉素耐药肠球菌循环有限。

各目标的总log₁₀削减值（LRV）存在显著基因特异性差异（Friedman检验，p<0.05）：bla_AmpC为3.7±1.0，bla_CTX-M为3.1±0.6，bla_NDM-1为2.5±0.9，bla_TEM为2.7±0.4，int1为3.0±0.4，mcr-1为2.2±0.1，mecA为2.1±0.4，sul1为1.6±0.3，tetB为3.4±0.6。sul1的削减量显著低于其他所有ARGs，与其在环境水体中的优势地位和持久性相符。

CAS系统（氯化前）获得的LRVs与总LRVs无显著差异（Wilcoxon符号秩检验，p>0.05），表明氯化消毒步骤对ARGs和MGE的额外削减贡献极小。尽管CAS系统对bla_AmpC、bla_CTX-M、int1和tetB的削减超过99.9%，但由于进水浓度较高，出水中bla_CTX-M、bla_TEM、int1和tetB仍保持可观浓度，表明WWTP仍是向受纳水体传播AMR的来源。

3.3 追踪ARGs命运的过程指示物

粪便指示物（crAssphage、pBI143、sfmD、gyrB、HF183-TaqMan）的总LRVs存在显著差异（Friedman检验，p<0.05）。HF183-TaqMan的LRV最高，pBI143最低。Spearman秩相关分析显示，pBI143仅与1个ARG显著相关，int1、crAssphage、HF183-TaqMan和gyrB各与3个ARG显著相关，而sfmD与4个ARG显著相关，提示sfmD可能作为同时反映粪便污染和耐药动态的补充指示物。与此前研究不同，pBI143在本研究中相关性有限，表明其虽可作为保守的源追踪指示物，但可能无法可靠反映ARGs在处理过程中的去除行为。

3.4 亚洲社区中ARGs和MGE的分布

所有四国样本中bla_AmpC、bla_CTX-M和bla_TEM检出率极高，仅泰国3份样本和越南1份样本呈阴性。bla_NDM-1在越南检出率最高（80%），日本次之（73%），菲律宾和泰国各50%。sul1、tetB和int1在四国均100%检出。mcr-1检出率因国家而异：日本和越南较高，菲律宾中等，泰国较低。vanA在日本和菲律宾均未检出，泰国检出率10%，越南高达90%。这些差异提示各国存在特定的选择性压力和流行病学条件。

3.5 不同国家ARGs谱型分析

主成分分析（PCA）中，PC1和PC2共解释78%的总方差（PC1：60%，PC2：18%）。得分图显示样本按国家明显聚类，形成两个独立谱型：A组（日本和泰国）主要沿PC1分布，与bla_AmpC、bla_CTX-M、bla_TEM、int1、mcr-1、sul1和tetB相关，其中bla_CTX-M、sul1和tetB载荷最强；B组（越南和菲律宾）主要沿PC2分布，与bla_NDM-1、mecA和vanA相关。B组相关基因主要关联WHO细菌优先病原体清单（BPPL）中列为关键和高优先级的病原体，具有重大临床意义。越南和菲律宾的临床监测数据（碳青霉烯耐药率、MRSA和万古霉素耐药率上升）与本研究结果一致。A组相关基因虽也涉及BPPL所列病原体，但主要关联一线治疗药物而非最后防线药物，mcr-1虽赋予对最后防线抗生素粘菌素的耐药性，但数十年来在畜牧业中广泛用作治疗和促生长剂，其来源可能为环境。这些结果提示日本和泰国样本的ARG谱型更接近社区相关耐药性，而越南和菲律宾样本则可能受医疗机构相关来源影响。

四、讨论与结论

本研究存在若干局限性：A组样本仅依赖单一WWTP；B组各国样本浓缩方法不同、样本基质异质、采样时间不重叠；样本量较小；仅关注有限数量的ARGs；qPCR定量的是基因拷贝数而非活菌或功能性表达；HT-qPCR预扩增步骤可能引入扩增偏差；PCA结果需谨慎解读，因未直接采样医院或社区来源，ARG谱型可能受废水基础设施、河流/运河稀释、上游输入、动物废物、工业排放和采样差异等因素影响。

研究结论指出：HT-qPCR检测在废水基质中表现出稳健的分析性能；基因特异性LRVs差异显著，bla_AmpC和int1削减较高，sul1显著较低，凸显其作为环境优势ARG的持久性；氯化对ARGs和MGE的额外去除贡献极小，凸显传统消毒在控制耐药传播方面的局限性；尽管CAS处理实现了一定削减，但多数ARGs在出水中仍保持可观浓度，对受纳水体和下游生态系统构成风险；int1和粪便标记物sfmD可作为ARG去除的可靠过程指示物；PCA识别出两种不同的ARG谱型，日本和泰国呈现社区相关耐药模式，越南和菲律宾则可能受医疗机构相关来源影响。这些发现强调需要改进废水处理策略并制定区域针对性的监测方法，以保护下游生态系统和公众健康。废水监测计划应纳入AMR行动计划，同时需要投资先进处理技术和区域特定监测框架，以加强环境AMR传播的控制，特别是在亚洲中低收入国家。