RecurIndex衍生分子特征与三阴性乳腺癌剂量密集新辅助化疗后tpCR相关：一项结合单细胞转录组学背景的探索性前瞻性队列研究

《Cancer Biology & Therapy》：RecurIndex-derived molecular features associated with total pathological complete response in triple-negative breast cancer: An exploratory prospective cohort study with single-cell transcriptomic contextualization

背景：用于预测三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）反应的可靠生物标志物仍有限。研究人员探讨了RecurIndex衍生分子特征是否与总病理完全缓解（total pathological complete response, tpCR）相关。方法：分析了74例接受剂量密集NAC治疗的TNBC患者。采用逻辑回归和受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析评估RecurIndex风险评分、18个核心基因与tpCR之间的关联。临床–分子模型通过bootstrap重采样进行内部验证。公开单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据用于生物学背景阐释。结果：29例患者（39.2%）达到tpCR。远处复发评分（distant recurrence score）与tpCR显著相关。OBSL1、BLM和CCR1被确定为候选tpCR相关基因。结合OBSL1、BLM和临床淋巴结分期（clinical nodal stage, cN）的模型达到曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.838，乐观校正后AUC为0.799。结论：RecurIndex衍生分子特征与TNBC中的tpCR相关。这些探索性发现需要在独立队列中验证。关键词：三阴性乳腺癌；新辅助化疗；病理完全缓解；RecurIndex；基因表达特征。

研究背景：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）以雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）缺失为特征，约占乳腺癌的15%–20%，临床行为侵袭且分子异质性明显。新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）是II–III期TNBC的关键治疗策略，病理完全缓解（pathological complete response, pCR）与良好长期结局强相关。然而NAC反应差异大，现有临床病理因素如肿瘤分期和Ki-67预测能力有限，可靠分子生物标志物仍临床需要。RecurIndex是28基因逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）表达检测，主要在亚洲乳腺癌人群中开发评估，用于估计局部和远处复发风险，辅助术后治疗决策，尤其激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌。该panel含18个功能靶基因和10个参考基因，涉及细胞增殖、细胞周期调节、DNA损伤修复和免疫反应；这些过程也与TNBC化疗敏感性和耐药相关。因此研究人员假设RecurIndex衍生风险评分和个体分子特征可能提供NAC反应信息，但其在TNBC新辅助场景中的价值尚未系统研究。为此，研究人员开展多中心、前瞻性、探索性观察队列，在接受剂量密集或剂量强化NAC的TNBC患者中，用治疗前粗针活检评估RecurIndex衍生的局部复发风险（local recurrence risk, LRR）和远处复发风险（distant recurrence risk, DR）评分与总病理完全缓解（total pathological complete response, tpCR）的关联，随后分析panel内基因以识别与tpCR相关分子特征，构建临床–分子预测模型，并用公共单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据提供候选基因的生物学背景。

研究人员纳入来自中国医科大学附属第一医院、第四附属医院和辽宁省肿瘤医院的患者，第一附属医院为协调中心。研究最初计划约100例，因符合全部条件者较少，共连续入组78例合格患者，排除4例因NAC不完整、活检样本质控失败或未手术/缺术后病理评估，最终74例分析。主要终点tpCR定义为NAC后乳腺和腋窝淋巴结无残留浸润癌（ypT_0/is, ypN₀），允许乳腺残留导管原位癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）。患者接受剂量密集蒽环和紫杉类NAC，EC方案序贯紫杉（paclitaxel或docetaxel），缩短间隔，按临床指征给予粒细胞集落刺激因子等支持，不常规使用含铂方案；NAC完成后4周内手术。研究人员得出，RecurIndex衍生DR评分及包括OBSL1和BLM在内的选定分子特征与tpCR相关，分子特征与临床淋巴结状态（clinical nodal stage, cN）整合后对tpCR预测显示有希望区分度，单细胞分析提供补充背景。这些发现为TNBCNAC反应预测提供候选分子和模型线索，但属假设生成，需独立验证。

关键技术方法：采用多中心前瞻性观察队列，来源为中国医科大学附属第一医院、第四附属医院和辽宁省肿瘤医院，最终74例II–III期TNBC接受剂量密集NAC；治疗前粗针活检用于RecurIndex 28基因RT-qPCR检测（18个靶基因+10个参考基因）并计算LRR和DR评分；使用逻辑回归、受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线、bootstrap内部验证、LASSO（least absolute shrinkage and selection operator）惩罚回归、校准曲线、Brier评分和决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）构建和验证临床–分子模型；同时利用公共单细胞RNA-seq数据集GSE263995，经Seurat质控、Harmony整合、聚类和细胞类型注释，采用FeaturePlot和DotPlot、差异表达、基因本体（Gene Ontology, GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和Hallmark富集、AddModuleScore及CellChat分析进行生物学背景阐释。

结果：基线患者特征与tpCR状态（Baseline patient characteristics and tpCR status）方面，74例中29例（39.2%）达到tpCR；tpCR与非tpCR组在诊断年龄、Ki-67、临床肿瘤分期（clinical tumor stage, cT）和组织学分级上无统计学显著差异，cN分布总体比较有显著差异。RecurIndex风险评分对tpCR的预测价值（Predictive value of RecurIndex risk scores for tpCR）方面，单因素逻辑回归显示DR评分每增加1个标准差（standard deviation, SD）与tpCR更高几率相关（比值比（odds ratio, OR）=1.668；95%置信区间（confidence interval, CI）1.025–2.851；p=0.048），LRR评分无显著关联（OR=1.329；95% CI 0.828–2.191；p=0.246）；tpCR组DR评分中位数高于非tpCR组[33.9（四分位距（interquartile range, IQR）29.3–36.9）比28.2（IQR 23.9–34.7）；p=0.033]，LRR差异不显著；ROC分析中DR评分的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.648（95% CI 0.517–0.780），LRR为0.561（95% CI 0.423–0.699）；探索性按cN分层，cN阴性患者DR的AUC为0.824（95% CI 0.624–1.000），cN阳性为0.546（95% CI 0.365–0.727），但cN阴性亚组小，需谨慎。差异表达基因鉴定（Identification of differentially expressed genes）方面，通过比较18个核心基因，BLM、OBSL1、CCR1和BUB1B在tpCR组表达显著更高（BLM p=0.003；OBSL1 p=0.007；CCR1 p=0.023；BUB1B p=0.049），其余基因无显著差异，并进行了错误发现率（false discovery rate, FDR）调整作为敏感性分析；这四个基因作为候选生物标志物进入后续回归分析。与tpCR相关因素的单因素逻辑回归分析（Univariate logistic regression analysis of factors associated with tpCR）方面，年龄、cT和Ki-67无显著关联；cN显著，较高淋巴结负荷与较低tpCR可能性相关；OBSL1、BLM和CCR1高表达与tpCR显著相关，BUB1B未达显著；因此cN和这三个基因进入多变量分析。多因素逻辑回归分析（Multivariable logistic regression analysis）方面，OBSL1仍与tpCR显著相关，BLM和CCR1调整后未达统计显著，BLM呈临界关联，CCR1作用较弱且不显著；三者方向与单因素一致，提示OBSL1可能为独立预测因素，BLM和CCR1可能在联合模型中贡献。整合临床因素的模型构建与验证（Construction and validation of integrated models incorporating clinical factors）方面，将cN与候选基因整合构建临床–分子模型，OBSL1+BLM+cN模型区分度最高，AUC为0.838，1000次bootstrap重采样后乐观校正AUC为0.799；校准显示预测与观察概率合理一致，Brier评分最低（0.156，对比0.208和0.200）；DCA显示在约0.13–0.70阈值概率范围内，该模型净获益高于仅cN模型及全部治疗和全部不治疗策略。LASSO敏感性分析在保守1个标准误规则下，OBSL1、BLM、CCR1和淋巴结分期保留非零系数；100次重复分层五折交叉验证中，OBSL1、BLM和cN选择频率最高（分别为79%、75%和74%），CCR1为59%，而Ki-67、cT、年龄和BUB1B较少或从未保留，支持OBSL1、BLM和cN在探索性建模中的相对稳定性，但临床应用前仍需外部验证。OBSL1、BLM和CCR1相关细胞状态的单细胞转录组表征（Single-cell transcriptomic characterization of OBSL1, BLM, and CCR1-associated cellular states）方面，利用GSE263995治疗前TNBC样本，鉴定出上皮肿瘤样细胞、单核/巨噬谱系细胞、T细胞亚群、B细胞、浆细胞、内皮细胞和成纤维/周细胞基质细胞等；OBSL1主要富集于上皮肿瘤样细胞，CCR1主要定位于单核/巨噬谱系细胞，BLM表达较广且在增殖T细胞中相对突出。OBSL1高上皮肿瘤样细胞富集RNA加工、小GTP酶信号、核质运输、DNA代谢、黏着斑、黏附连接和整合素信号，提示转录活跃状态。BLM高细胞的Hallmark模块评分在DNA修复、E2F targets、G₂/M checkpoint、有丝分裂纺锤体和MYC targets V1上高于BLM低细胞，并在增殖T细胞和上皮肿瘤样细胞中较突出，提示跨区室增殖和DNA修复相关转录状态。CCR1高髓系细胞富集干扰素反应、炎症和补体相关信号、IL6/JAK/STAT3信号、溶酶体和吞噬通路及胞葬作用（efferocytosis），提示免疫激活状态和增强的吞噬、溶酶体活性；CellChat分析显示CCR1高髓系细胞与多种免疫、上皮、内皮和基质区室存在预测相互作用，尤其与细胞毒性T/自然杀伤（natural killer, NK）细胞、上皮肿瘤样细胞和基质细胞通信较突出，提示其嵌入活跃的肿瘤–免疫–基质通信网络。

讨论与结论：研究人员总结，RecurIndex主要在亚洲人群开发，既往用于激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌术后复发风险评估和辅助治疗决策，其在TNBC新辅助场景中的效用尚未充分表征。本研究中DR评分与tpCR显著相关，DR对治疗反应的观察AUC较高，提示RecurIndex两个输出可能捕获部分不同的生物学维度，远处复发相关分子特征可能与全身化疗反应更重叠；cN阴性患者DR的AUC较高，但小样本，应视为假设生成。基因层面，OBSL1、BLM和CCR1为主要候选。BLM参与DNA损伤修复和基因组稳定性，CCR1参与肿瘤微环境免疫和髓系细胞信号，OBSL1为细胞骨架衔接蛋白，涉及微管动力学和基因组完整性。多变量分析中OBSL1仍独立相关，BLM和CCR1调整后效应减弱，提示治疗反应不太可能由单一分子标志物充分代表。单细胞分析提供补充背景：OBSL1主要在上皮肿瘤样细胞并关联黏附、细胞骨架、核质运输和DNA代谢程序；BLM分布多区室并关联增殖和DNA修复状态；CCR1主要在单核/巨噬谱系并关联炎症、干扰素、吞噬和溶酶体程序；这些候选基因可能反映互补的肿瘤内在和免疫相关状态。整合cN与分子特征改善模型区分度，OBSL1+BLM+cN模型表现最佳，bootstrap校正后区分度仍可接受，校准合理且Brier评分最低；重复LASSO支持OBSL1、BLM和cN相对稳定，DCA提示相对cN单独具有增量决策支持价值。概念上，tpCR预测概率较高者可能适合标准NAC，较低者未来研究可评估强化或替代策略；但目前无验证的tpCR概率阈值指导TNBC治疗选择，这些发现仍为探索性，不建立临床治疗截断值。局限包括：尽管多中心，样本量和tpCR事件有限，模型缺乏独立外部验证；分子发现基于转录组测量，无蛋白水平或功能验证；TNBC分子异质性，包括免疫激活、基底样和雄激素受体阳性亚型，可能未被当前临床–分子模型完全捕获；需更大型独立TNBC队列及互补分子数据验证和完善。研究结论翻译：在这项探索性多中心研究中，RecurIndex衍生的DR评分以及包括OBSL1和BLM在内的选定分子特征，与TNBC患者接受剂量密集或剂量强化NAC后的tpCR相关。将分子特征与临床淋巴结状态整合后，对tpCR预测显示出有希望的区分度，而单细胞分析为所识别的候选标志物提供了补充生物学背景。这些发现具有假设生成性，需要在更大型独立TNBC特异性队列中验证。