线性聚乙烯亚胺（L-PEI）材料的质子化状态与抗衡离子相互作用研究

《Gels》：Insights into the Protonation State and Counterion Interactions of Linear Polyethyleneimine Materials

　　

聚乙烯亚胺（PEI）聚合物广泛用于合成纳米颗粒、水凝胶和复合材料，应用于生物技术和环境领域。然而，线性PEI（L-PEI）材料的固态结构组织及其受分子量、质子化状态和抗衡离子类型的影响尚未被全面研究。在本工作中，研究人员将固态核磁共振（ss-NMR）、X射线粉末衍射（XRD）、小角X射线散射（SAXS）和时域核磁共振（TD-NMR）实验与理论计算相结合，分析了不同分子量L-PEI材料的局部化学环境、结晶和纳米尺度组织以及分子流动性。所分析的材料包括自由碱（PEI·FB）、盐酸盐（PEI·HCl）、三氟乙酸盐（PEI·TFA）和含硫酸盐形式的L-PEI（PEI·Na₂SO₄和PEI·H₂SO₄），以及通过HCl饱和异丙醇异相处理获得的中间质子化状态。质子（¹H）、¹³C或¹⁵N ss-NMR研究揭示了与质子化状态和抗衡离子种类变化相关的不同化学环境。此外，XRD和SAXS表明，这些变量连同分子量和样品制备条件，共同影响了聚合物链的晶体排列和特征纳米尺度组织。此外，TD-NMR揭示了三种动力学上不同的质子群体的存在，分别归属于刚性域、界面域和流动域，其相对贡献和弛豫行为随PEI材料的不同而变化。最后，研究人员使用高分辨率魔角旋转（HRMAS）NMR实验研究了不同的PEI凝胶材料和薄膜，以及质子化PEI与硫酸根离子的交联。

线性聚乙烯亚胺（L-PEI）材料因高电荷密度和结构可调性，在基因递送、抗菌、环境修复等领域应用广泛。与支化PEI（B-PEI）不同，L-PEI仅含仲胺，可形成半结晶结构，其有序固态组织有利于形成更稳定且细胞毒性更低的复合物。然而，L-PEI的固态结构组织及其受分子量、质子化状态、抗衡离子类型和制备条件的影响此前缺乏系统研究；常规溶液态核磁共振对低溶解性或交联体系分辨率不足。为此，研究人员开展了多技术联用的固态表征研究。

研究人员以11、22、87和217 kDa的L-PEI为对象，制备了自由碱（PEI·FB）、盐酸盐（PEI·HCl）、三氟乙酸盐（PEI·TFA）、硫酸盐（PEI·Na₂SO₄和PEI·H₂SO₄）以及经HCl饱和异丙醇异相处理得到的中间质子化态（PEI-IPA·HCl），并首次报道了PEI·TFA及硫酸盐L-PEI的固态结构。联合固态核磁共振（ss-NMR）、X射线粉末衍射（XRD）、小角X射线散射（SAXS）、时域核磁共振（TD-NMR）和密度泛函理论（DFT）计算，研究揭示了分子量、质子化状态、抗衡离子和制备条件如何共同调控L-PEI的局部化学环境、结晶组织、纳米尺度结构和分子流动性，并通过高分辨率魔角旋转（HRMAS）NMR将研究扩展至溶胀凝胶和薄膜。

主要技术方法包括：样本来源为Sigma-Aldrich的聚(2-乙基-2-噁唑啉)（PEOX，25、50、200和500 kDa），经酸性水解合成11–217 kDa的PEI·HCl。ss-NMR采用¹H、¹³C、¹⁵N交叉极化魔角旋转（CP-MAS）及二维¹H-¹H单量子-双量子（SQ-DQ）实验；XRD用于晶相鉴定；SAXS用于纳米尺度结构分析；TD-NMR采用魔幻回波（MSE）脉冲序列测量质子弛豫；DFT用于计算¹³C/¹⁵N化学位移；HRMAS NMR用于溶胀样品分析。

研究结果如下。

2.1 XRD和固态NMR研究：XRD显示PEI·FB样品的结晶水合物相（半水合物、一水合物、二水合物）随分子量和制备条件改变；使用非新鲜蒸馏水会出现碳酸氢盐共结晶。¹³C CP-MAS谱中PEI·FB的化学位移（约48–54 ppm）高于PEI·HCl（约38–47 ppm），但不同分子量间无明显差异。IPA·HCl处理产生部分质子化的多个¹³C信号（51、48、44和43 ppm）。¹H MAS及二维SQ-DQ证明水分子为流动性的非结构水。¹⁵N CP-MAS显示抗衡离子盐形式的¹⁵N化学位移与自由碱接近，不能单独指示质子化。PEI·TFA的XRD谱包含尖锐反射和非晶背景，表明有序与无序区域共存。

2.2 DFT计算：计算表明，质子化使骨架碳¹³C化学位移向高场移动约9.3（Cl^?）或11.5（TFA）ppm，而链间堆积贡献不足1 ppm；氯离子可诱导链折叠，TFA则因位阻阻止折叠；部分质子化导致化学位移分散达7.8 ppm，与PEI-IPA·HCl的多信号实验现象一致。

2.3 分子动力学：TD-NMR的MSE-FID分析分辨出刚性、界面和流动三类质子群体。PEI·HCl流动组分T₂高达约1.3 ms，显著大于PEI·FB的约0.07–0.1 ms，表明非刚性域运动平均化更强。硫酸盐材料刚性组分比例最高（PEI·Na₂SO₄为72%，PEI·H₂SO₄为70%），与硫酸根作为二齿抗衡离子桥接交联一致；PEI·TFA刚性组分较PEI·HCl降低约8个百分点，Abragam参数增大，反映TFA局部改变刚性域堆积。

2.4 SAXS研究：所有干燥样品的低q区呈现表面分形行为（幂律指数3.5–4），高q区存在对应长周期56–76 ?的相关峰。抗衡离子类型和样品处理对纳米尺度有序结构的影响大于分子量；硫酸盐样品显示一级和二级反射，表明层状堆积；PEI·TFA相关峰宽且移向低q。

2.5 HRMAS NMR研究：PEI-EGDE凝胶可在水或乙腈中合成，两者¹³C HRMAS谱相似，但乙腈中反应时间从120分钟缩短至40分钟；该凝胶在CDCl₃中溶胀度达980%±67%。¹³C HRMAS谱显示淀粉-PEI薄膜中PEI的δ¹³C为44.1 ppm，而PEI-EGDE凝胶中PEI存在43.3和43.7 ppm两种环境；凝胶在100 mM Na₂SO₄/D₂O中溶胀后出现46.6 ppm新信号，归属为质子化PEI胺基与硫酸根离子的离子交联。PEI·H₂SO₄和PEI·Na₂SO₄粉末因溶胀度低未得到HRMAS信号。

讨论与结论：综合多尺度表征结果，L-PEI的固态结构组织与分子动力学并非仅由结晶度或刚性域比例决定，质子化状态和抗衡离子的配位方式对聚合物链堆积和迁移率起主导作用。这些固态特征在溶胀凝胶和薄膜中依然保持。研究结论可概括为：L-PEI材料的结构组织和分子动力学共同取决于质子化状态、抗衡离子类型、分子量、水合程度和加工历史，这些特征在其凝胶和薄膜中持续存在；该多技术表征框架为未来合理选择L-PEI形式以开发纳米颗粒、响应性凝胶、薄膜和基因递送系统提供了依据。