《Foods》：Influence of Fermentation Methods on Jujube Wine Quality: A Volatile Metabolomics-Based Investigation
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摘要专业翻译
与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及筛选的非酿酒酵母（non-Saccharomyces）进行混合发酵是生产具有独特香气果酒的有效途径。本研究旨在通过评估多菌株顺序接种策略来提升枣酒的香气复杂性。两株本土非酿酒酵母菌株
摘要专业翻译
与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及筛选的非酿酒酵母（non-Saccharomyces）进行混合发酵是生产具有独特香气果酒的有效途径。本研究旨在通过评估多菌株顺序接种策略来提升枣酒的香气复杂性。两株本土非酿酒酵母菌株，即葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）TD74和发酵毕赤酵母（Metschnikowia pulcherrima）HJ79，被顺序接种并与酿酒酵母（S. cerevisiae）联合发酵。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术，结合电子鼻、电子舌及化学计量学分析，对不同接种条件下生产的枣酒的理化性质和挥发性化合物谱进行了分析。与单菌株发酵相比，两株非酿酒酵母的顺序接种产生了显著更为独特的挥发性谱。特别是，三菌株顺序接种组（MHS）表现出更高半定量水平的大多数乙酯类化合物，酒中具有更明显的水果香气，这与感官分析结果一致。这些发现表明，使用多种非酿酒酵母是增强枣酒香气多样性和整体感官品质的有效策略，为工业化枣酒生产中优化发酵剂菌种的合理设计提供了理论基础。
论文解读
一、研究背景与意义
果酒的香气特征由品种香气、发酵香气和陈酿香气共同决定，其中发酵香气主要来源于酵母代谢产生的次级代谢产物。虽然自然发酵能够赋予果酒与本土微生物群落和原料相关的独特香气特征并增强复杂性，但其固有的不可控性、易发生迟滞发酵以及周期长等缺陷限制了其在工业生产中的应用。因此，商业化果酒生产主要依赖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的纯种发酵，以保证发酵过程可控并实现糖向乙醇的高效转化。然而，单一酵母菌株发酵通常导致相对固定的代谢谱，香气多样性不足。为兼顾自然发酵的微生物多样性优势与工艺可控性，利用本土非酿酒酵母（non-Saccharomyces）与酿酒酵母进行混合发酵已成为改善果酒风味品质的有效策略。
非酿酒酵母主要通过酶活性增强果酒香气，包括释放β-葡萄糖苷酶水解果实中非挥发性糖苷键合香气前体，以及合成酯酶催化脂肪酸酯的形成与水解，直接塑造果酒酯类组成。然而，多数非酿酒酵母因对高糖、高乙醇等酿造胁迫耐受性较弱，无法独立完成糖向乙醇的转化，因此顺序接种策略应运而生——在发酵初期接种非酿酒酵母以最大化其酶促作用，随后接种酿酒酵母以保证糖的完全利用和乙醇的高效生成。
枣（Ziziphus jujuba Mill.）是中国具有重要经济价值的果树作物，其中“灰枣”是新疆主栽商业品种之一，目前主要用于鲜食和干制，高附加值深加工产品尤其是发酵饮品开发相对有限。研究人员前期从自然发酵枣汁中分离出两株具有高β-葡萄糖苷酶活性的非酿酒酵母——葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）TD74和发酵毕赤酵母（Metschnikowia pulcherrima）HJ79，并系统评价了其酿造学特性和酶学性质，但这两株菌在枣酒发酵中的增香效果及其与酿酒酵母的相互作用尚不清楚。本研究旨在系统比较不同接种策略下枣酒发酵终点挥发性化合物谱的差异，阐明非酿酒酵母在混合发酵中的增香作用，并筛选出最优接种策略，为枣酒混合发酵剂设计提供理论依据。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员以新疆灰枣为原料制备枣汁，设置了7个实验组：未发酵枣汁对照（CK）、酿酒酵母MST纯种发酵（Sc）、发酵毕赤酵母HJ79纯种发酵（Mp）、葡萄汁有孢汉逊酵母TD74纯种发酵（Hu）、发酵毕赤酵母HJ79先接种2天后接种酿酒酵母的顺序发酵（MS）、葡萄汁有孢汉逊酵母TD74先接种2天后接种酿酒酵母的顺序发酵（HS），以及发酵毕赤酵母HJ79与葡萄汁有孢汉逊酵母TD74同时接种2天后接种酿酒酵母的三菌株顺序发酵（MHS）。发酵在20°C下进行，以残糖连续72小时不变作为发酵终点判定标准。
研究采用的主要技术方法包括：平板计数法结合WLN培养基上菌落形态差异监测混合发酵中各酵母菌种群动态；分光光度法测定β-葡萄糖苷酶活性；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）结合NIST 8.0和Wiley 7质谱库检索及保留指数比对鉴定挥发性化合物，以4-辛醇为内标进行半定量分析并计算相对气味活度值（ROAV）；电子鼻（E-Nose）配备28个传感器评价香气特征；电子舌（E-Tongue）配备6个惰性金属工作电极评价味觉特征；偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结合变量重要性投影（VIP）筛选差异挥发性化合物；10名受过训练的评价员进行感官评价。
三、研究结果
3.1 酵母种群动态与β-葡萄糖苷酶活性
单菌株发酵中，酿酒酵母MST生长迅速，第4天达到峰值生物量9.5 Log CFU/mL；葡萄汁有孢汉逊酵母TD74和发酵毕赤酵母HJ79生长相对缓慢，分别于第5天达到峰值8.81和8.96 Log CFU/mL。双菌株顺序发酵中，两株非酿酒酵母的生长受到一定程度抑制，其中发酵毕赤酵母HJ79受抑制更为明显，峰值生物量仅达8.25 Log CFU/mL。三菌株顺序发酵（MHS）中，两株非酿酒酵母的生物量均高于各自双菌株发酵组，下降速率更慢，且发酵时间缩短。β-葡萄糖苷酶活性变化趋势与酵母种群动态基本一致，接种酿酒酵母后酶活和菌量均快速下降，表明非酿酒酵母生物量与β-葡萄糖苷酶活性密切相关。
3.2 发酵过程中糖与乙醇的变化
Sc组可溶性固形物含量下降最快，发酵终点残糖6.1 g/L、乙醇12.57% vol。Mp和Hu纯种发酵组发酵能力较弱，当乙醇浓度达约4% vol时糖消耗明显减缓，终点残糖仍高于110 g/L，乙醇低于6% vol，表明发酵因糖利用不完全而停滞。顺序接种有效结合了两类酵母的优势，HS和MS组均在18天内完成发酵。MHS组终点可溶性固形物7.0 °Brix、残糖7.2 g/L、乙醇11.9% vol，表明酿酒酵母MST在三菌株发酵中作为主要耗糖菌，非酿酒酵母可能对其耗糖效率产生一定干扰。
3.3 枣酒理化特性
所有发酵样品总酸均高于枣汁，含非酿酒酵母的发酵组总酸普遍高于Sc组（4.5 g/L），pH值也低于Sc组，与非酿酒酵母产酸能力较强一致。所有发酵样品L值升高、a和b值降低，ΔE值介于7.52至12.98之间且均大于5，表明不同接种策略引起的颜色变化肉眼可辨。所有发酵组总酚和总黄酮含量均高于CK组，混合发酵组总酚含量显著高于所有单菌株组，其中MHS组总酚含量最高，较CK组提高33.0%，可能与其较高β-葡萄糖苷酶活性促进结合态多酚水解有关。顺序发酵组的自由基清除活性高于单菌株发酵组，MHS组DPPH和ABTS清除活性最高，Hu组羟自由基清除活性最高（60.07%），MS组还原力最高（2.69）。
3.4 顺序发酵对枣酒挥发性香气化合物的影响
3.4.1 组成分析
共鉴定出164种挥发性化合物，包括51种酯类、43种醇类、26种酸类、19种醛类、10种酮类和15种其他化合物。所有发酵方式均显著提高了挥发性化合物总半定量水平，混合发酵组显著高于Sc单菌株组。MHS组总半定量水平最高（6700.65 μg/L），MS组检出化合物种类最丰富（95种）。22种化合物为所有组共有，其中异戊醇半定量水平最高。
酯类是枣酒中含量最丰富的挥发性化合物类别，51种酯中有44种来源于发酵过程，26种仅在混合发酵组中检出。乙酯类为优势酯类，MHS组乙酯总半定量水平最高（3337.80 μg/L），乙酸乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯为三种主要乙酯。MHS组乙酸乙酯半定量水平达2035.95 μg/L，可能归因于发酵菌株较高的酶活性。乙酸酯类中，乙酸异戊酯、乙酸己酯和乙酸异丁酯为主要成分，其中赋予果香的乙酸己酯仅在含发酵毕赤酵母的发酵组中检出。
高级醇是另一大类挥发性化合物，混合发酵组在组成和半定量水平上均具明显优势，MHS组高级醇总含量最高（2891.33 μg/L），3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-甲基丁醇为主要贡献者。Hu组挥发性酸半定量水平最高，乙酸、辛酸和癸酸为主要酸类，但因气味阈值较高对酸味和奶油味的贡献有限。苯乙醛在MS组显著升高（314.65 μg/L），β-大马士酮在Mp组最高（47.76 μg/L），分别赋予蜂蜜和玫瑰样香气。乙偶姻仅在Mp和Hu单菌株组检出，苯乙烯仅在MHS组检出。
3.4.2 ROAV分析
β-大马士酮在所有样品中ROAV=100，为参考香气化合物，赋予苹果、玫瑰和蜂蜜样复合香气。辛酸乙酯在Sc（10.25）和MS（11.93）组ROAV最高，其贡献主要集中在以酿酒酵母为主导的发酵体系中。己酸乙酯在所有处理组中均保持较高ROAV（Sc 4.13、MS 4.09、HS 2.83、MHS 4.58），是枣酒果香基底的重要组成。乙酸异戊酯仅在MS（1.09）和MHS（1.41）组ROAV≥1。苯乙醛在Hu（8.33）、MS（13.27）和HS（5.12）组赋予蜂蜜样香气。γ-癸内酯仅在Mp组ROAV>1（1.10），与苯乙醇（1.61）共同塑造桃-花香特征。MHS组呈现以己酸乙酯（4.58）和乙酸异戊酯（1.41）为主、苯乙醇（1.51）补充玫瑰花香的综合果香-花香特征。
3.4.3 偏最小二乘判别分析
PLS-DA模型拟合优度R2Y=0.992、预测能力Q2=0.971，200次置换检验确认模型无过拟合。CK组与发酵组、单菌株发酵组与混合发酵组均被清晰区分。共鉴定出26种VIP值>1的差异化合物，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇、苯乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸异戊酯等，是区分七组样品的关健挥发性成分。
3.5 感官轮廓分析
电子鼻结果显示，发酵样品在S11、S12、S13、S25、S26、S27和S28传感器上响应显著增强，这些传感器主要响应烷烃、酯类、醇类和酮类。PCA分析中，混合发酵组沿PC1轴紧密聚集，表明整体香气轮廓相似，但沿PC2轴与Sc组清晰分离，反映非酿酒酵母的代谢贡献。Mp和Hu组聚类在一起但与其他组明显分离，具有独特的香气特征。电子舌结果显示，MHS和Mp组在部分响应变量上数值略高，CK组整体响应较低，味觉特征不突出。PCA累计贡献率达97.78%，不同接种策略显著改变了枣酒的味觉指纹。
3.6 感官评价结果
Sc组“酒精味”得分较高，而“花香”和“果香”得分较低，整体香气较单薄。Hu和Mp组在“生青味”和“甜味”上得分较高，但反映了发酵不完全对整体品质的损害。混合发酵策略改善了香气品质：HS组“花香”得分较高，与苯乙醇和萜类化合物含量高相关；MS组“果香”突出。混合发酵组在“涩感”控制上优于Sc组，酸甜平衡更和谐。MHS组在花香、果香和坚果香属性上得分最高，生青味和溶剂味得分较低，酸度和甜度适中，感官轮廓最为均衡。
四、讨论与结论
本研究表明，非酿酒酵母与酿酒酵母的顺序接种有效提高了枣酒的总酚和总黄酮含量，改善了抗氧化活性，并显著增强了香气复杂性。与酿酒酵母单菌株发酵相比，多菌株顺序接种能够产生更高水平的酯类和醇类，赋予酒体突出的花香和果香特征，感官评价得分也最为 favorable，尤其在花香和果香方面。研究证实，接种多种非酿酒酵母是增强枣酒香气多样性和品质的有效策略，为枣酒生产中发酵剂菌种设计及风味品质调控提供了理论依据。
需要指出的是，本研究存在一定局限性：混合发酵中酚类和挥发性谱增强的具体酶学及调控机制尚不明确；非酿酒酵母与酿酒酵母接种间隔2天及接种比例均为固定值，未进行优化。后续需通过多组学研究、不同延迟时间和接种比例的比较以及中试规模验证，以确认该顺序接种策略的工业适用性。
