保加利亚市场红曲米食品补充剂中monacolin K内酯的质量与真实性评价：HPLC-PDA、LC-MS与GC-MS/MS互补分析

《Foods》：Quality and Authenticity Evaluation of Red Yeast Rice Food Supplements from the Bulgarian Market

　　

红曲米（Red Yeast Rice，RYR）食品补充剂中monacolin组成存在显著变异性，引发对产品质量、标签准确性及法规符合性的担忧。本研究采用互补的HPLC-PDA、LC-MS与GC-MS/MS方法，对从保加利亚市场购买的14种含RYR食品补充剂进行评价。应用经过验证的HPLC-PDA方法定量测定monacolin K（MK）内酯型和monascorubrin，LC-MS用于身份确证，GC-MS/MS用于靶向筛查未申报的simvastatin和rosuvastatin。在最大生产商推荐日剂量下，测得的lactone MK摄入量为0.06至14.11 mg/day，表明产品间存在显著差异，且测得MK浓度与标签声明之间存在不一致。三种产品的lactone MK水平为≥3 mg/day。然而，由于未定量hydroxy acid型和其他monacolins，这些结果不能直接解释为用于法规评估的RYR来源总monacolin摄入量。在所应用分析条件下，未检出simvastatin或rosuvastatin。在所应用分析条件下，任何受分析产品中均未检出monascorubrin；因此，其未检出不能证明产品真实性，且当前发现不支持将其用作成品RYR补充剂的独立真实性标志物。总体而言，结果证明从保加利亚市场购买的RYR食品补充剂中测得MK-lactone含量存在显著变异性，并强调改进分析表征和产品标准化的重要性。

论文主体内容解读

高胆固醇血症（hypercholesterolemia），尤其是低密度脂蛋白（LDL）胆固醇升高，是动脉粥样硬化性心血管疾病发生的主要危险因素；与总胆固醇正常者相比，高胆固醇血症患者发生心血管疾病的风险约增加一倍。LDL升高通常通过生活方式改变和他汀类药物（statins）治疗。除常规治疗外，多种食品补充剂（Food Supplements，FSs）宣称具有降胆固醇作用，其中含红曲米（Red Yeast Rice，RYR）的产品被报道可降低总胆固醇和LDL-C。RYR是米（Oryza sativa L., Poaceae）经Monascus属丝状真菌，最常见Monascus purpureus Went.，发酵得到的传统产品；尽管称为红曲米，M. purpureus在分类上是丝状真菌（霉菌）而非酵母。发酵过程中产生复杂次生代谢物，包括使RYR呈红色的色素、甾醇、有机酸、多糖和其他生物活性化合物，并产生monacolins；其中monacolin K（MK）具有降胆固醇活性，被视为RYR关键活性成分。MK有两种形式：lactone型，与statin药物lovastatin结构相同；以及hydroxy acid型。美国将含MK产品按药品管理；欧盟将RYR制品作为食品补充剂销售，monacolins受Regulation (EC) No. 1925/2006附件III，经Commission Regulation (EU) 2022/860修订后的条件和标签要求约束。欧洲食品安全局（EFSA）认为，RYR monacolins暴露可能使MK摄入落入lovastatin治疗剂量范围，且RYR来源monacolins的不良反应谱与lovastatin相似。Commission Regulation (EU) 2022/860将RYR monacolins列入Part B“限制物质”和Part C“联盟审查物质”；Part B规定，供每日消费的产品单个份量必须提供少于3 mg的RYR monacolins。重要的是，该法规条件适用于RYR monacolins总体，而非仅MK lactone型。

除安全性外，RYR FS还存在质量和安全问题。MK和其他monacolins含量可因Monascus菌株、底物、发酵条件、加工、储存和配方差异而在产品间显著变化。市场监测研究反复显示monacolin含量显著变异、声明量与实测值常常不符，甚至存在未声明monacolin含量的情况。RYR补充剂报告的不良反应主要影响肌肉骨骼系统（肌病、肌痛，罕见横纹肌溶解）、肝脏（转氨酶升高，罕见急性肝炎）和胃肠道，与lovastatin特征相似。虽然严重事件与处方他汀相比似乎非常罕见，但已有在低至3 mg/day monacolin摄入时出现个体病例、包括需要住院的报道。自用药和产品间monacolin含量巨大变异使安全性评估复杂化。产品质量评估还受发酵相关污染物和未申报药理活性物质可能出现的复杂化。citrinin（桔霉素）是Monascus发酵可能产生的肾毒性真菌毒素，但本研究未调查citrinin和其他真菌代谢物，因此其超出当前分析评价范围。近期证据表明，仅citrinin缺失不足以确认产品安全，因为其他毒性真菌代谢物也可能出现。天然产生的MK与添加的合成lovastatin之间的分析区分尤其困难，因为二者化学相同。RYR补充剂的全面表征可能需要更广泛地分析monacolins、发酵相关代谢物、真菌毒素和未申报药理活性物质。本研究聚焦MK-lactone定量、monascorubrin评价和选定未申报他汀的靶向筛查。尽管既往研究记录了商业RYR补充剂monacolin含量显著变异，本研究目的是评价从保加利亚市场购买的含RYR食品补充剂，定量MK lactone型，在适用时与可分析比较的标签声明进行比较，并筛查选定未申报药理活性物质。由于未定量MK hydroxy acid和其他monacolins，直接评估符合EU总monacolins监管条件不在本分析方法范围。该互补分析方法提供产品特异的MK-lactone变异数据，同时明确考虑MK-lactone作为总monacolin含量替代物以及常规分析方法用于真实性评价的局限性。

研究人员对14种从保加利亚药房和在线零售商购买的RYR FS进行评价，样本并非旨在提供保加利亚全市场统计代表性调查，而是对市售产品的分析评价。研究采用HPLC-PDA、LC-MS和GC-MS/MS互补方法。结果显示，在最大生产商推荐日剂量下，MK-lactone测得量为0.06至14.11 mg/day，产品间差异显著，且与标签声明存在不一致；三个产品含lactone MK水平≥3 mg/day；未检出simvastatin和rosuvastatin；monascorubrin在所有受分析产品中均未检出，因此不支持其作为成品RYR补充剂的独立真实性标志物。总体而言，这些结果证明从保加利亚市场购买的RYR食品补充剂中测得MK-lactone含量存在显著变异，并强调改进分析表征和产品标准化的重要性。从临床角度看，消费者按不同产品推荐日剂量使用时可能暴露于显著不同的药理活性MK-lactone量，标签信息与实测MK-lactone含量不一致可能进一步使实际消费者暴露估计复杂化；但本研究未评估临床结局，不能仅根据分析数据得出单个产品有效性或安全性的结论。从监管角度看，三个产品在最大推荐日剂量下提供≥3 mg/day的测得MK-lactone；符合或超过3 mg/day限值不能等同于存在或不存在安全 concern，该限值反映Regulation (EU) 2022/860中的监管决定，而monacolin不良反应的剂量-反应关系仍表征不足；且该法规适用于RYR总monacolins，而本分析方法仅定量MK lactone型，因此测得MK-lactone值不能单独用于判定法规符合或不符。研究局限性包括分析食品补充剂数量相对有限且限于保加利亚市场、citrinin和其他真菌代谢物未在范围内、天然MK-lactone与外加lovastatin无法用本研究色谱和质谱方法区分；需来源判别方法如稳定同位素分析来解决。

技术方法概要：样本为从保加利亚药房和在线零售商购买的14种标示含RYR食品补充剂，非全市场代表性调查；样品避光、15–25 °C保存，并在标示有效期前分析。采用互补HPLC-PDA、LC-MS和GC-MS/MS。HPLC-PDA用Shim-pack C18柱，水/乙腈30:70等度洗脱，1.0 mL/min，40 °C，进样10 μL，MK在约239 nm、monascorubrin在473 nm检测；外标法验证线性、准确度、精密度、LOD/LOQ、稳健性、稳定性和基质效应。LC-MS同柱，水相含0.1%甲酸，采用TIC和SIM确证目标物。GC-MS/MS用ZB-5MSplus柱，全扫描和MRM靶向筛查simvastatin、MK、rosuvastatin，未衍生化。

研究结果：

3.1. HPLC-PDA Method Performance and Validation（HPLC-PDA方法性能与验证）
3.1.1. Method Performance（方法性能）：研究人员开发快速、灵敏的HPLC-PDA方法，用于FS中MK和monascorubrin的定量。MK和monascorubrin清晰分离，保留时间分别为5.179 min和9.92 min，保留时间重现性良好，相对标准偏差不超过0.2%。系统适用性测试计算选择性因子（α）、分离度（Rs）、理论塔板数（N）和对称因子（As），符合美国药典要求，显示色谱系统满足选择性和效率要求。
3.1.2. Method Validation（方法验证）：线性结果显示高线性；准确度通过回收率评价，在考察浓度范围内准确性高；精密度显示低变异性，RSD在可接受范围内。LOD和LOQ由线性数据按LOD = 3.3*σ/S和LOQ = 10*σ/S计算。稳健性方面，柱温38–42 °C、流动相组成±2%和流速小变动未导致分离度或保留时间显著变化。稳定性方面，标准品在2–8 °C储存一周稳定，进样器15 °C放置24 h后重新分析也稳定。基质效应方面，MK在10、20、30 μg/mL时分别为100.09%、104.55%和105.48%，显示轻微信号增强；monascorubrin分别为100.45%、91.76%和95.42%，显示可忽略至中度信号抑制。对14个样品中MK进行峰纯度分析，纯度角均低于阈值，证实峰光谱均一且无共洗脱干扰。
3.2. LC-MS：LC-MS方法用于检测和确证rosuvastatin、simvastatin、MK和monascorubrin，TIC和SIM模式均可可靠识别目标物。MK由m/z 405、422和427确认；monascorubrin由m/z 383和401确认；rosuvastatin由m/z 482和504确认；simvastatin由m/z 419和441确认。各分析物保留时间与相同色谱条件下标准品一致，分别为rosuvastatin t_R = 1.860 min、MK t_R = 5.235 min、simvastatin t_R = 6.621 min、monascorubrin t_R = 10.024 min。SIM模式提高选择性，目标物保留时间处未观察到显著干扰信号。
3.3. Quantification of Monacolin K and Monascorubrin in Commercial RYR（商品RYR中MK和monascorubrin定量）：14种RYR FS中MK含量差异显著，最大推荐日剂量下范围为0.06至14.11 mg/day。三个产品（Samples 10、12和14）lactone MK≥3 mg/day；但法规限制适用于RYR总monacolins而非仅MK lactone型，因未定量MK hydroxy acid和其他monacolins，不能直接评估是否符合总monacolin限值。最高测得MK-lactone为Sample 12（14.11 mg/day），但其标签未声明定量MK量。标签与实测值存在明显不一致：Samples 1、4、6、9和11含量明显低于厂家标示；Sample 14实测超过声明两倍多；部分产品仅报告RYR或总monacolin含量而未具体说明MK；Samples 2、3、7、8、12和13未提供MK含量明确信息；Samples 5和13的MK水平极低。LC-MS进一步确证MK，而monascorubrin在所有样品中未检出；这可能与其化学不稳定性、加工/干燥/提取/封装/储存或氧和光暴露下降解、Monascus菌株、发酵条件、底物和下游工艺影响、商业产品使用部分纯化RYR提取物以及LC-MS离子化效率有关。因此，monascorubrin缺失不一定表明掺假，但说明其不是成品食品补充剂足够稳健的独立真实性标志物，应辅以其他化学标志物或先进分析方法如稳定同位素分析。对MK浓度最高的Samples 12和14，需进一步采用稳定同位素比分析、手性色谱或核磁共振波谱等研究MK来源。靶向筛查未检出simvastatin或rosuvastatin，支持MK是所测样品中主要他汀样化合物，并在方法检测限内排除常用合成他汀的存在。
3.4. GC-MS/MS Screening for Undeclared Synthetic Statins（未申报合成他汀的GC-MS/MS筛查）：GC-MS/MS分析用全扫描表征提取物挥发性谱，用MRM提高目标他汀灵敏度和选择性。所有样品均检出MK，TIC筛选和靶向MRM均确认。rosuvastatin和simvastatin在所有样品中均未检出。结果表明，在所应用实验条件下，MK是唯一检出的他汀样化合物，支持所分析产品在天然来源方面无常用合成他汀掺假，但不排除其他结构相关或未知化合物。
3.5. Comparison with Previous Studies（与既往研究比较）：既往欧洲市场RYR FS评价发现若干产品含>3 mg monacolins，存在潜在安全性担忧；虽未检出合成他汀且样品符合citrinin限值，但部分产品被怀疑掺有lovastatin。本研究结果与大量文献一致，显示RYR补充剂组成、质量和安全性显著变异。既往研究报道MK含量范围宽，有的为0.09–5.48 mg/1200 mg RYR，许多产品未声明MK；有的为1.51–9.88 mg/份，高至10.09 mg/胶囊，有时超过推荐安全限。本研究14种RYR FS在最大推荐日剂量下MK-lactone为0.06–14.11 mg，但直接数值比较应谨慎，因为本研究仅定量MK-lactone，而既往研究分析物和报告单位不同。与本研究一致，标签与实测MK含量差异普遍，既往报告偏差为声明值的1.9%至153.5%，有些产品高于或低于标示甚至无MK。采用UHPLC-MS和1H-NMR等技术也发现仅少数产品符合标签声明。次要monacolins和降解产物可占总monacolin含量37%，其相对分布随总MK水平变化，使质量评估和安全性评价复杂化。本研究仅定量MK lactone型，未测hydroxy acid型，无法评价lactone/hydroxy acid比值；该比值被认为是区分天然发酵RYR与可能掺有合成lovastatin产品的附加标志物。simvastatin和rosuvastatin被选为靶标的原因包括：simvastatin是lovastatin的半合成衍生物，侧链多一个甲基，结构接近MK，是MK标准化产品中可能的未申报药用他汀；rosuvastatin是广泛处方的全合成他汀。既往唯一报告在RYR补充剂中发现simvastatin的研究在37种产品中的30种检出痕量（0.1–7.5 μg/日剂量），但作者未确定是否为故意掺假，且另一项35种RYR补充剂独立筛查未检出合成他汀。因此，simvastatin证据仅基于单一报道。本研究靶向筛查针对保加利亚市场该问题，阴性结果仅适用于所测化合物和条件。掺假和污染已有报道，包括lovastatin和痕量simvastatin，但本研究未观察到simvastatin或rosuvastatin可检测信号。该发现不应解释为产品真实性或天然来源的证据，因为发酵来源MK-lactone和外加lovastatin化学相同，用本研究所用HPLC、HPLC-MS/MS和GC-MS无法可靠区分。既往报道提示药用lovastatin可能被非法加入RYR产品以提高monacolin含量。lactone和acid型比例曾被提出作为掺假指标；稳定碳同位素（δ¹³C）分析已用于检测掺假，在 chromatographic isolation 和EA–IRMS分析后，以δ¹³C阈值?28.3‰识别出若干非天然来源样品。citrinin也是一项重要安全 concern，既往研究报告其在RYR产品中频繁出现，有时超过法规限值，而其他研究未发现污染。citrinin虽非本研究重点，但其记录到的变异性进一步强调需要全面质量控制。总体而言，本研究结果与既往文献高度一致，确认RYR食品补充剂在组成、标签准确性和安全性方面存在显著异质性，强调需要更严格监管、统一分析方法和改进生产标准化。

讨论部分总结：从临床角度，所分析产品间MK-lactone暴露差异显著，消费者按不同厂家推荐日剂量使用可能暴露于明显不同的药理活性MK-lactone量，标签与实测MK-lactone不一致可能使实际暴露估计复杂化；但本研究未评估临床结局，不能仅由分析数据得出单个产品有效性或安全性结论。从监管角度，三个产品最大推荐日剂量下测得≥3 mg/day lactone MK，但符合或超过3 mg/day限值不能等同于存在或不存在安全 concern；该限值反映Regulation (EU) 2022/860监管决定，而monacolin不良反应剂量-反应关系仍表征不足。该法规适用于RYR总monacolins，本研究仅定量MK lactone型，因此测得值不能单独确定法规符合或不符。本研究局限性包括分析产品数量相对有限且限于保加利亚市场，citrinin和其他真菌代谢物超出范围，天然MK与外加lovastatin的区分仍具分析挑战，发酵来源MK-lactone与外加药用lovastatin不能通过本研究所用色谱和质谱方法区分，因此检出MK-lactone本身不能证明产品天然来源或真实性，也不能排除外加lovastatin掺假；需稳定同位素分析等来源判别方法。未来研究应纳入更多市场和批次产品，全面分析MK-lactone、MKA、其他monacolins、Monascus来源色素和其他发酵相关代谢物，并在需要评价MK来源和真实性时考虑稳定同位素分析等来源判别方法。

研究结论翻译：本研究证明保加利亚市场RYR食品补充剂中lactone MK含量存在显著变异性，且分析测定浓度与产品标签信息之间存在差异。在最大生产商推荐日剂量下，测得lactone MK暴露为0.06至14.11 mg/day，其中三个产品含≥3 mg/day lactone MK。由于未定量MK hydroxy acid型和其他monacolins，这些值代表总monacolin含量的下限，不能直接等同于用于法规符合性评估的RYR来源总monacolin摄入。在所应用靶向分析条件下，未检出simvastatin或rosuvastatin；然而，其缺失不能确定MK的天然来源或排除其他形式的掺假。在所分析样品中，未观察到对应simvastatin或rosuvastatin的可检测信号。然而，该发现不能确定所检出MK的天然来源或真实性。发酵来源MK-lactone和外加lovastatin化学相同，使用本研究所应用的分析方法无法区分。因此，未检出simvastatin和rosuvastatin仅应解释为在应用分析条件下针对这些特定靶标化合物的阴性结果，而非产品真实性的证据。