《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification of the Castanea mollissima MADS-Box Gene Family and Its Potential Roles in Female Flower Development Based on Transcriptomic and Morphological Analyses
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板栗（Castanea mollissima）是我国重要的木本粮食作物。雌花分化迟、数量少且不稳定制约了板栗产业的发展。本研究选取两个多雌花品种‘龙泉庄2号’（LQ）和‘燕秋’（YQ）以及对照品种‘燕山早丰’（ZF），在芽萌发后7–35 d的五个时期进行形态学
板栗（Castanea mollissima）是我国重要的木本粮食作物。雌花分化迟、数量少且不稳定制约了板栗产业的发展。本研究选取两个多雌花品种‘龙泉庄2号’（LQ）和‘燕秋’（YQ）以及对照品种‘燕山早丰’（ZF），在芽萌发后7–35 d的五个时期进行形态学观察和转录组测序。形态学差异在芽萌发后21 d开始显现。转录组分析在21 d的LQ–ZF比较中鉴定出2223个特异差异表达基因（DEGs），并在21–35 d期间鉴定出791个品种间共有的差异表达基因。基因本体（GO）富集分析显示转录因子活性及相关通路显著富集。转录因子预测将MADS-box基因列为候选基因，并在中国板栗中鉴定出60个MADS-box成员，包括29个Type I成员和31个Type II成员，后者被划分为13个亚家族。基因表达模式与预测蛋白相互作用的综合分析表明，更多Type II基因在雌花中差异表达，且多雌花品种与对照品种间的表达模式存在差异。推测的正调控与负调控CmMADS因子的对比表达模式可能与这些品种间雌花发育能力的差异相关。对四个代表性CmMADS基因的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，在雌花中高表达的基因通常随发育进程表达量上升，与转录组数据一致。这些发现揭示了两个多雌花板栗品种与对照品种在雌花发育过程中的形态学分化及动态CmMADS表达，为探究其潜在分子调控网络提供了基础，但目前功能验证仅限于转录组水平的预测，仍需进一步的实验验证。
板栗雌花发育的形态学与转录组学研究解读
一、研究背景与科学问题
板栗（Castanea mollissima）隶属于壳斗科（Fagaceae）栗属，是我国重要的木本粮食作物，燕山板栗作为知名地理标志产品具有重要经济价值。尽管栽培技术已趋成熟，但雄花过多、雌花不足以及雌花分化率低等问题长期未获解决，导致单位面积产量和经济收益受限，制约了板栗产业的可持续发展。雌花在芽萌发后进入形态分化期，该时期常与生理分化同步发生，分化时间短而集中，约持续60 d。板栗雌花中雄蕊位于雌蕊柱头下方，提示花原基保留两性发育潜力，花序类型和性别分化可能在花芽分化过程中通过分子、生理及栽培干预得以调控。雌花分化能力在不同品种间存在差异，长期田间调查和种质收集鉴定出LQ和YQ为多雌花品种，ZF为常规对照品种。LQ和YQ每结果枝雌花簇数分别为3.2和3.3，ZF仅为1.6；雌花簇与雄花序比值分别为1:2.4、1:4.3和1:5.9。细胞学观察显示三个品种在四月中旬芽萌发后的发育进程大体相似，但LQ和YQ在混合花序可见时表现出更先进的分化状态和更有利于雌花簇发育的结构。以往研究多集中于单一品种的花器官解剖、性状变异、内源激素及花芽转录组分析，对不同雌花形成能力品种间的系统比较仍十分有限，尤其是多雌花种质的研究更为缺乏。因此，阐明板栗雌花发育的调控机制对于理解产量形成的分子基础以及通过分子育种改善雌花分化具有重要意义。
转录因子在多种生物学过程中调控靶基因表达，花器官身份经典地由ABC模型描述，后扩展至D类和E类功能，多数ABCDE基因属于MIKC型MADS-box转录因子家族。MADS-box基因依据结构和进化特征分为Type I（SRF-like）和Type II（MEF2-like）两类，Type II基因结构更复杂，进一步分为MIKCC和MIKC两组。MIKC基因通常参与雌雄配子体发育，MIKCC基因在花器官发育中发挥更广泛作用，包含至少14个亚家族。在ABCDE模型中，MADS-box蛋白形成转录复合物，分别决定萼片（A）、花瓣（A+B+E）、雄蕊（B+C+E）、心皮或雌蕊（C+E）以及胚珠（D）的身份。多种植物中已开展MADS-box家族的全基因组鉴定与功能表征，但板栗中其作用仍未完全阐明。
二、研究内容与主要结论
为鉴定可能参与板栗雌花发育的基因，研究人员将多雌花品种LQ和YQ与对照品种ZF进行比较，在关键发育阶段进行形态学观察和转录组测序，通过差异表达基因比较分析将MADS-box转录因子列为候选基因。全基因组分析鉴定出60个CmMADS基因，依据K-box结构域的存在与否分为29个Type I和31个Type II基因。四个代表性基因经RT-qPCR验证，CmMADS8、CmMADS36和CmMADS56在多雌花品种中高表达且随发育进程总体上升，CmMADS16则呈现相反模式。多品种时间序列分析有助于区分表达模式与品种特异性变异，加强了候选基因与雌花发育之间的关联。
三、主要关键技术方法
研究地点位于河北省秦皇岛市昌黎县河北科技师范学院板栗种质资源圃（119.52° E，39.93° N），属暖温带半湿润季风气候。选取十年生嫁接树LQ、YQ和ZF各三株作为生物学重复，在芽萌发后7、14、21、28和35 d采集混合花序或雌花簇样本，共45个生物学样本。主要技术方法包括：形态学观察与记录；Illumina NovaSeq 6000平台转录组测序，HISAT2比对参考基因组，StringTie组装并估计表达量，DESeq2进行差异表达分析，clusterProfiler进行GO富集分析；PlantTFDB转录因子预测与TBtools-II Binding Motif Scan模块进行结合位点预测；本地BLAST与HMMER隐马尔可夫模型搜索鉴定MADS-box基因家族成员，MEGA11构建邻接树；TBtools进行染色体定位、共线性及Ka/Ks分析；PlantCARE进行顺式作用元件预测；STRING基于拟南芥同源基因构建蛋白互作网络；RT-qPCR验证代表性基因表达。
四、研究结果
4.1 板栗混合花序和雌花早期发育的形态学观察
在芽萌发后7 d的花序原基分化期，雌雄花无法通过肉眼区分。14 d进入展叶期，花序开始伸长，但雌雄花结构仍无法区分。21 d萼片原基开始分化，ZF混合花序发育慢于LQ和YQ，品种特异性形态分化在此阶段显现。28 d雌蕊原基分化进行中，两性花序可见，LQ和YQ的雌花簇更为清晰可见，早期雌花发育基本完成。35 d所有雌花簇清晰可辨，LQ和YQ的雌花簇早于ZF可见。形态学观察表明板栗雌花发育是动态过程，最大分化差异约在21 d出现。
4.2 转录组测序数据质量评估
Pearson相关系数显示同一发育阶段的生物学重复高度相关，主成分分析中每组三个点形成紧凑聚类，证实数据可重复性和可靠性。测序获得441.4 Gb干净碱基，每样本至少7 Gb，错误率0.01%，GC含量43.35%–44.37%，Q20超过98%。45个质控样本中89.24%–90.54%的干净读段比对到板栗基因组，超过77%比对到外显子区域。
4.3 品种间差异表达基因分析
LQ与ZF在7、14、21、28和35 d的比较分别鉴定出4140、3544、8113、6698和6339个DEGs，YQ与ZF对应比较鉴定出4204、4507、3609、3597和6893个DEGs。21 d萼片原基分化开始时，LQ vs. ZF特异性DEGs数量急剧增加，21、28和35 d分别有2223、1039和1425个DEGs仅存在于该比较中。以7 d为基线的动态比较中，LQ在21 d的DEGs数量也急剧增加，且两个多雌花品种中上调基因多于下调基因。这些结果将21 d与雌花发育的关键转变相关联。
4.4 差异表达基因的GO富集分析
结合21、28和35 d三个品种对比较的基因，LQ vs. ZF三个比较共有2702个DEGs，YQ vs. ZF共有1622个，两组合并后鉴定出791个共同DEGs。这些基因显著富集于两个转录因子活性通路、一个DNA依赖性转录通路和一个核酸依赖性转录通路。除三个基因外，DEGs在多雌花品种中表达总体上升，在ZF中7 d达峰值后下降，表明多雌花品种与ZF在雌花发育中后期呈现不同的转录特征。
4.5 转录因子筛选
将791个DEGs比对到拟南芥，鉴定出20个编码转录因子的基因：七个AP2、五个WRKY、三个MADS-box、两个NAC、两个MYB和一个C2C2。结合基序扫描预测MADS-box转录因子可结合191个DEGs的启动子。三个MADS-box基因在多雌花品种中表达高于ZF且随雌花发育总体上升，支持将MADS-box基因列为板栗雌花发育研究的候选基因。
4.6 CmMADS基因家族分析
4.6.1 CmMADS家族的鉴定、理化性质、系统发育和基因结构分析
鉴定出60个CmMADS基因并按染色体位置命名为CmMADS1–CmMADS60，所有编码蛋白均预测定位于细胞核。系统发育分析将60个蛋白分为两大类：29个Type I（M型）蛋白，分为Mα、Mβ、Mγ和Mδ亚家族；31个Type II（MIKC型）蛋白，包含FLC、PI、AP3、GGM13、AGL17、AGL12、AG、SOC1、AGL6、SEP、AP1、AGL15和SVP共13个亚家族。Type I和Type II基因在保守基序和外显子-内含子结构上存在明显差异，Type II基因结构更复杂。
4.6.2 CmMADS基因的染色体定位和共线性分析
57个基因不均等地分布于11条染色体上，CmMADS58、CmMADS59和CmMADS60未组装到大染色体支架。种内共线性分析鉴定出11个重复基因对，其中9个为片段重复，是家族扩增的主要贡献者，2个为串联重复。所有Ka/Ks比值均小于1，表明重复基因经历纯化选择。种间共线性分析显示板栗与橡树（同为壳斗科）间保守同源基因最多，其次为番茄和拟南芥，与单子叶植物玉米和水稻间的共线性块较少且较小。
4.6.3 CmMADS启动子顺式作用元件
光响应元件在Type I启动子中最为丰富，占鉴定元件的50%以上，在Type II启动子中比例低6.5%，伴随激素、胁迫及生长发育响应元件比例增加。光响应和激素响应元件分别约占全部元件的50%和25%。Type II启动子中生长发育响应元件比例更高，提示Type II基因可能在雌花分化和种子形态建成中发挥重要作用。
4.6.4 CmMADS蛋白互作网络预测
将60个CmMADS蛋白比对到拟南芥，49个蛋白与20个拟南芥蛋白相关联。AP1、FLC、SVP和AGL24可能调控开花；AGL62、AGL1、AGL11、AGL61、AGL80和TT16可能参与胚珠发育；SEP1、SEP3、AP3、PI、AG、AGL6、AGL65、AGL104和AGL82可能在花发育中发挥作用。该网络基于拟南芥同源基因的已知互作，尚未在板栗组织中实验验证。
4.6.5 互作网络中CmMADS基因的表达
22个CmMADS基因在三个品种中均有表达，一个为LQ特异，一个在LQ和YQ中表达，其余25个在转录组中无差异表达。Type II基因在雌花发育中总体表达较高。11个基因（CmMADS2、CmMADS3、CmMADS5、CmMADS8、CmMADS32、CmMADS35、CmMADS37、CmMADS40、CmMADS41、CmMADS46和CmMADS56）在LQ和YQ中高表达而在ZF中低表达；四个基因（CmMADS1、CmMADS36、CmMADS54和CmMADS59）在三个品种中表达水平和趋势相似；七个基因（CmMADS16、CmMADS17、CmMADS19、CmMADS20、CmMADS33、CmMADS47和CmMADS55）在ZF中高表达而在LQ和YQ中低表达。多雌花品种中高表达基因通常随发育上升，ZF中高表达基因通常随发育下降。
4.6.6 RT-qPCR验证
基于24个基因的表达谱和预测功能互作，选择与AG、AP1、PI和SVP四个代表性蛋白相关的CmMADS基因进行RT-qPCR验证。CmMADS8、CmMADS36和CmMADS56随雌花发育总体上升，可能与雌花发育正相关；CmMADS16表达下降且在ZF中水平更高，可能与雌花发育负相关。RT-qPCR结果与RNA-seq数据一致。
五、讨论与结论
形态学和转录组证据共同确定芽萌发后21 d为品种间性别分化差异出现的关键节点。LQ和YQ继续正常分化并在28 d基本完成早期雌花发育，ZF则发育延迟或受阻。21、28和35 d的DEGs分析鉴定出791个多雌花品种与ZF间持续差异表达的基因，富集于转录因子活性等通路，支持转录调控在雌花分化中的核心作用。60个CmMADS基因的系统鉴定显示Type II基因数量比拟南芥多13.5%，可能反映Type II基因较高的重复率。片段重复是家族扩增的主要驱动力，纯化选择维持了功能保守性。板栗与橡树间共线性最强，与拟南芥的强同源性支持其作为比较模型。Type II基因内含子更多更长，可能增加选择性剪接机会和调控复杂性。启动子顺式元件分析支持CmMADS基因感知环境和内源激素信号并作出转录响应的调控模型。表达模式分析鉴定出11个在多雌花品种中高表达且随发育上升的基因，属于SEP、PI、AP3、AG和AGL6亚家族；七个在ZF中高表达且随发育下降的基因属于GGM13、SVP和Mδ亚家族。这些对比模式为多雌花与对照品种间雌花分化差异提供了候选调控因子。
研究结论：板栗雌花发育是动态过程，品种间最大分化差异约在芽萌发后21 d出现，多雌花品种在28 d基本完成早期形态建成。转录组分析将MADS-box转录因子列为与这一发育转变相关的候选基因。鉴定出60个板栗MADS-box基因，含29个Type I和31个Type II基因。Type II基因内含子更多更长，可能与其较高表达相关。整合预测蛋白互作与转录组表达模式，鉴定出11个在多雌花品种中高表达且总体上升的CmMADS基因，属于SEP、PI、AP3、AG和AGL6亚家族；七个来自GGM13、SVP和Mδ亚家族的基因在ZF中高表达且随发育下降。这些对比模式为多雌花与对照品种间雌花分化差异提供了候选调控因子，其具体功能仍需实验验证。
