《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification of the TCP Gene Family in Tetraploid Potato and Analysis of Their Potential Roles in Tuber Development
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马铃薯块茎形成是一个复杂的发育过程，受多种植物激素和基因协同互作调控。TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR (TCP) 转录因子在植物生长、发育和环境刺激响应中发挥重要作用；然而，其在四倍
马铃薯块茎形成是一个复杂的发育过程，受多种植物激素和基因协同互作调控。TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR (TCP) 转录因子在植物生长、发育和环境刺激响应中发挥重要作用；然而，其在四倍体马铃薯块茎发育中的具体功能仍知之甚少。在本研究中，研究人员对四倍体马铃薯TCP基因家族进行了全基因组鉴定和系统表征，整合转录组分析（transcriptome profiling）、定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、蛋白质-蛋白质互作预测和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA），以鉴定可能与块茎发育相关的候选基因。共在29条染色体上鉴定出57个StTCP基因，并划分为8个亚家族。同一亚家族成员通常具有相似的基因结构、保守基序和蛋白质结构域，而其启动子区域含有大量与光和植物激素响应、生长发育及胁迫响应相关的顺式作用元件。表达谱分析显示，StTCP在温度胁迫下和块茎发育阶段间具有不同的表达模式。8个StTCP基因在四个发育阶段表现出显著的阶段特异性表达，其表达趋势得到定量实时PCR（qRT-PCR）的广泛支持。特别是，StTCP42、StTCP55和StTCP57在匍匐茎钩状期（stolon hook stage）的表达显著高于其他阶段（p < 0.05），而StTCP20在亚顶端膨大期（subapical swelling stage）显著上调（p < 0.05）。对四个发育阶段RNA-seq数据进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出27个共表达模块。turquoise、dark red、pink和green模块分别与匍匐茎钩状期、亚顶端膨大期、块茎初始形成期和块茎形成期显著正相关；其中turquoise模块与匍匐茎钩状期呈最强正相关（r = 0.997，错误发现率（false discovery rate, FDR）= 2.77 × 10?10）。值得注意的是，StTCP42和StTCP57均在匍匐茎钩状期高表达，并被分配到turquoise模块。StTCP42还表现出高模块成员度（module membership, kME = 0.930）和基因显著性（gene significance, GS = 0.937，p = 6.79 × 10?6），通过转录组、qRT-PCR和共表达证据为其与早期块茎发育的关联提供了汇聚性证据。本研究系统表征了四倍体马铃薯TCP基因家族，并鉴定出若干可能与块茎发育相关的候选基因，尤其是StTCP42和StTCP57。这些发现为未来阐明TCP转录因子在马铃薯块茎形成和发育中作用的功能研究提供了基础。
四倍体马铃薯块茎形成是一个受多激素和基因协同调控的复杂发育过程，涉及匍匐茎钩状期、亚顶端膨大期、块茎初始形成期和块茎形成期等阶段。TCP（TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR，植物特有转录因子）在植物生长发育和环境响应中作用重要，但其在四倍体马铃薯块茎发育中的具体功能尚不清楚；早期马铃薯TCP研究有限，Bao et al. 曾鉴定23个TCP基因，且四倍体基因组复杂，因此需要更全面的家族鉴定及其与块茎发育关联分析。为此，研究人员对四倍体马铃薯TCP基因家族进行全基因组鉴定和系统表征，整合转录组、qRT-PCR、蛋白质-蛋白质互作预测和WGCNA，寻找与块茎发育相关的候选基因。研究鉴定57个StTCP基因，分类为8个亚家族，发现结构保守和表达分化，并优先提出StTCP42、StTCP57等候选基因，为后续功能研究提供基础。
关键技术方法：研究人员从Pfam获取TCP结构域HMM（hidden Markov model，隐马尔可夫模型）profile PF03634，用HMMER v3.3.2检索Qingshu 9（Q9）蛋白质组；用MUSCLE v5.1和FastTree 2.1.11构建最大似然（maximum-likelihood, ML）树；用MEME v4.11.2、NCBI CDD和TBtools-II分析保守基序、结构域和基因结构；用PlantCARE预测2-kb启动子顺式作用元件；用BLASTN v2.5.0和MCScanX进行共线性分析。RNA-seq数据来自NGDC和NCBI SRA，温度响应数据为Qingshu No. 9 BioProject PRJCA006877，块茎发育四阶段数据为BioProject PRJNA1436775；qRT-PCR材料为Qingshu No. 9；WGCNA使用12个RNA-seq样本，经DESeq2方差稳定化转换后构建网络。
研究结果：
2.1 基因家族成员鉴定与蛋白质特征：通过HMMER检索Q9蛋白质组，研究人员鉴定57个StTCP基因，分布于29条染色体，对应单倍体12条染色体中的10条；合并同源染色体后，Chr03最多14个（24.6%），Chr07和Chr11无成员，其余染色体各有3–7个。蛋白长度86–611个氨基酸，CDS（coding sequence，编码序列）长度261–1836 bp，分子量9.92–64.69 kDa，理论等电点（theoretical isoelectric point, pI）5.11–10.74；86%蛋白不稳定指数>40，所有蛋白GRAVY（grand average of hydropathicity，总平均亲水性）为负，71%蛋白pI>7。
2.2 系统发育树构建与StTCP基因家族亚家族分类：通过将57个StTCP与24个AtTCP、46个ZmTCP、36个SlTCP和22个OsTCP共185个蛋白进行系统发育分析，研究人员将其分为8个亚家族I–VIII；马铃薯StTCP主要分布在II、IV、VI、VII和VIII亚家族，其中VIII亚家族最大，含28个成员。
2.3 基因结构、蛋白质结构和保守基序：通过基因结构、保守结构域和MEME基序分析，研究人员发现32个StTCP为单外显子，22个为双外显子，3个为三外显子，同亚家族成员结构相似；29个蛋白含TCP超家族结构域，17个含TCP2超家族结构域，11个含TCP结构域，无成员同时含两个以上结构域。MEME鉴定10个保守基序，54个成员含motif 1和motif 2，而StTCP33、StTCP34和StTCP36缺乏这两个主要基序。
2.4 顺式作用元件分析：通过PlantCARE预测2-kb启动子，研究人员鉴定28类顺式作用元件，涉及光响应、植物激素响应、非生物胁迫响应、昼夜节律和分生组织发育；光响应元件最丰富，共17类且存在于所有57个基因启动子中。激素响应元件中，ABA响应元件ABRE存在于40个基因（约70%），赤霉素响应元件存在于26个基因，生长素响应元件存在于18个基因；胁迫响应中，干旱响应MBS元件存在于23个基因，低温响应LTR元件存在于6个基因；昼夜节律相关元件存在于17个基因，分生组织和发育相关CAT-box存在于19个基因。
2.5 基因复制事件与共线性分析：通过五物种共线性分析，研究人员鉴定203个共线性基因对，其中58.6%为种间、41.4%为种内；番茄与马铃薯种间共线对最多，为53对，占所有种间共线关系的44.5%；水稻与玉米之间有41对；真双子叶物种与单子叶物种之间未检测到直接共线基因对。
2.6 StTCP基因表达模式分析：基于NGDC公开转录组数据，研究人员分析高低温处理下叶和根中的表达，发现StTCP基因具有组织及温度依赖表达模式，若干基因在温度处理后表达低于对照；StTCP19和StTCP38在高低温叶片中较高；StTCP1–StTCP5在高温下一般高于低温，并随高温时间延长而下降；StTCP17未检测到表达，StTCP21主要在对照中表达，StTCP9仅高温12 h叶片中检测到。块茎发育四阶段中，8个StTCP基因呈现阶段特异性表达：StTCP39、StTCP42、StTCP55和StTCP57在钩状期最高，随后降低；StTCP12和StTCP20在亚顶端膨大期达峰；StTCP1在初始块茎形成期最高；StTCP9在块茎发育期较高。
2.7 八个差异表达StTCP基因的qRT-PCR验证：通过qRT-PCR验证，研究人员发现表达趋势与转录组 broadly 一致；StTCP42、StTCP55和StTCP57在钩状期表达显著高于其他阶段（p < 0.05）；StTCP20在亚顶端膨大期最高且显著高于其他三阶段（p < 0.05），StTCP12也在该期最高；StTCP1在亚顶端膨大期和初始块茎形成期较高，钩状期最低；StTCP9在亚顶端膨大期和块茎形成期较高；StTCP39在亚顶端膨大期最低，其他阶段较高。
2.8 WGCNA鉴定与块茎发育阶段相关的StTCP基因：通过12个RNA-seq样本的四阶段WGCNA，研究人员在β = 18时鉴定27个共表达模块；turquoise模块最大，turquoise、dark red、pink和green模块分别与钩状期、亚顶端膨大期、初始块茎形成期和块茎形成期显著正相关，其中turquoise与钩状期相关性最强（r = 0.997，FDR = 2.77 × 10
?10），dark red与亚顶端膨大期相关（r = 0.973，FDR = 4.29 × 10
?6），pink与初始块茎形成期相关（r = 0.936，FDR = 1.42 × 10
?4），green与块茎形成期相关（r = 0.963，FDR = 1.37 × 10
?5）；blue、magenta、tan和brown模块负相关。57个StTCP中33个进入网络，turquoise含StTCP18、StTCP30、StTCP38、StTCP42和StTCP57，pink含StTCP5和StTCP54，green含StTCP46，dark red无符合过滤的StTCP。turquoise中kME与GS强相关（r = 0.979）；StTCP42的kME = 0.930，GS = 0.937（p = 6.79 × 10
?6）；StTCP18和StTCP38的kME分别为0.845和0.834，GS分别为0.841和0.796；StTCP30的kME和GS分别为0.755和0.749；StTCP57的kME和GS分别为0.625和0.629（p = 0.028）。WGCNA与RNA-seq和qRT-PCR部分一致，支持StTCP42和StTCP57与钩状期相关，其中StTCP42证据最一致，并提示StTCP18、StTCP38和StTCP30与钩状期、StTCP46与块茎形成期相关。
讨论总结：研究人员讨论认为，57个StTCP多于早期马铃薯研究中的31个和23个，可能与参考基因组组装和注释、鉴定标准以及四倍体中同源基因拷贝保留有关；染色体分布不均可能反映基因复制、染色体重排和差异保留。StTCP蛋白理化性质多样，多数不稳定指数高且亲水，但保留TCP相关保守结构域。系统发育显示TCP家族跨物种保守，同时亚家族成员数差异提示谱系特异保留、扩张和分化。基因结构和基序分析支持结构保守，但StTCP33、StTCP34和StTCP36缺乏motif 1和2，提示进化分化。启动子顺式元件提示StTCP可能受光、激素和胁迫等多信号调控，但预测不能证明直接互作。共线性分析支持家族保守和谱系特异分化，番茄与马铃薯高度共线，真双子叶与单子叶间无直接共线对，可能涉及染色体重排、基因丢失和基因组结构变化；马铃薯种内共线提示基因复制和多倍化贡献。表达谱和qRT-PCR支持不同StTCP成员与不同块茎发育阶段相关，但表达模式不能直接推断调控作用。WGCNA与表达分析仅部分一致，因方法捕获信息不同；StTCP42和StTCP57在钩状期高表达且属于turquoise模块，StTCP42获得最一致关联证据。研究局限在于主要基于生物信息学预测、表达分析和共表达关系，不足以确定直接调控功能；WGCNA仅用12个RNA-seq样本，模块-阶段关联需更多重复和独立数据验证；未来需基因编辑、过表达或沉默、亚细胞定位、下游靶标鉴定和蛋白互作实验验证StTCP42、StTCP57、StTCP18和StTCP38等功能。
研究结论翻译：本研究在四倍体马铃薯全基因组水平鉴定并系统表征了57个StTCP基因。系统发育、基因结构、保守基序和共线性分析揭示StTCP家族具有显著结构保守性，同时存在进化分化证据，可能与基因复制、多倍化和同源基因拷贝保留相关。启动子顺式作用元件分析进一步表明StTCP基因可能响应光、植物激素和环境胁迫等多种调控信号。表达谱显示StTCP成员在温度处理和块茎发育阶段间存在显著分化。8个基因表现出阶段特异性表达，并得到qRT-PCR广泛支持。WGCNA鉴定出27个共表达模块，其中turquoise、dark red、pink和green模块分别与匍匐茎钩状期、亚顶端膨大期、块茎初始形成期和块茎形成期显著正相关。StTCP42和StTCP57在匍匐茎钩状期表达较高并属于turquoise模块，其中StTCP42在RNA-seq、qRT-PCR和WGCNA分析中获得最一致支持。此外，StTCP18、StTCP38和StTCP46也作为与特定发育阶段相关的候选基因出现。总体而言，这些发现为理解四倍体马铃薯TCP基因家族提供了系统框架，并为未来块茎发育功能研究确定了优先候选基因。需要进一步实验验证以确定其具体生物学作用和调控机制。
