基于基因组与临床数据的实体瘤根治性放疗完全缓解预测研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Prediction of Tumor Complete Response Using Genomic and Clinical Data in Solid Cancer Undergoing Definitive Radiation Therapy

　　

摘要 在这项回顾性、单中心观察性研究中，研究人员对放疗（radiation therapy, RT）前的肿瘤标本进行了靶向二代测序（next-generation sequencing, NGS），以识别与放疗反应和临床结局相关的基因组特征。该研究纳入了2014年至2020年间接受治疗的77例符合条件的实体瘤患者，包括食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC，n = 23）、非人乳头瘤病毒相关头颈部鳞状细胞癌（non-human papilloma virus-related head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC，n = 24）和直肠腺癌（rectal adenocarcinoma, RAC，n = 30）。治疗以根治为目的（采用放化疗或术前放化疗后行根治性手术）。采用临床和病理学标准评估治疗反应，并将结果二分类为完全缓解（complete response, CR）与非完全缓解（non-CR）。研究人员采用包含161个基因的定制化panel进行靶向NGS。共在153个基因中鉴定出1263个非同义体细胞变异。最常见的变异基因为TP53（70.1%）、APC（41.6%）、NOTCH1（41.6%）、KMT2C（39.0%）、NOTCH3（36.4%）和NOTCH2（35.1%）。总体而言，25例（32.5%）和52例（67.5%）患者分别被归类为CR和非CR。APC（P = 0.008）、KMT2C（P = 0.018）和KRAS（P = 0.012）变异与非CR相关，而CD274（P = 0.003）、MSH3（P = 0.011）和NOTCH3（P = 0.048）变异与CR相关。KRAS变异仅发生于RAC中，且非CR肿瘤中大多数APC–KMT2C共变异也见于RAC，提示这些关联可能部分反映了肿瘤类型特异的基因组背景。一项纳入年龄和六个候选基因组变量的探索性合并模型实现了交叉验证曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.867的CR预测性能。在生存分析中，CCND1、CXCL9、ERCC6、LIF和RAD51B的变异与较差的无复发生存期独立相关。放疗前肿瘤基因组分析在该异质性队列中鉴定了与放疗反应和无复发生存相关的候选特征。合并的基因组关联和预测模型不应被解释为泛癌种生物标志物或预测因子，需要在更大规模、独立且癌症类型特异的队列中进行验证。

基于基因组与临床数据的实体瘤根治性放疗完全缓解预测研究——论文解读

一、研究背景与目的

放射治疗（radiation therapy, RT）是现代肿瘤治疗的核心手段之一，约半数癌症患者在病程中需要接受放疗，且放疗贡献了约40%的癌症治愈。然而，尽管治疗技术不断进步和治疗方案日趋标准化，患者对放疗的临床反应仍存在显著异质性。部分患者可实现完全肿瘤缓解，而另一些患者则因内在或获得性放射抵抗而出现局部复发或远处转移，最终导致较差的生存结局。这种持续存在的个体间差异凸显了对能够根据放射敏感性对患者进行分层并支持精准放疗的生物标志物的迫切需求。

随着高通量测序技术和生物信息学工具的快速发展，放射基因组学（radiogenomics）作为连接基因组变异与放疗反应及结局的研究领域应运而生。在细胞层面，电离辐射可诱导多种DNA损伤，其中DNA双链断裂是主要的细胞毒性事件。DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）网络通过协调损伤感知、细胞周期控制和修复过程，强烈影响放射敏感性和放射抵抗性。与此一致，DDR基因和通路（包括^TP53、^ATM和^BRCA1/2）的变异已被证实与多种肿瘤类型的治疗失败相关。此外，氧化应激、炎症、致癌信号和肿瘤-免疫相互作用也是放疗反应的重要决定因素。然而，既往评估肿瘤基因组特征与放疗反应关联的研究在研究设计、肿瘤类型、测序策略和基因内容等方面存在差异，导致结果异质性大，限制了临床转化应用。

针对上述问题，研究人员开发了一种富集DDR通路、癌症相关和免疫相关通路的定制化靶向二代测序（next-generation sequencing, NGS）panel，对接受根治性或术前放疗的多种实体瘤类型患者的放疗前肿瘤标本进行检测。研究旨在：（1）识别与放疗后完全缓解（complete response, CR）与非完全缓解（non-CR）相关的基因组变异；（2）表征与放疗反应相关的通路水平差异；（3）利用靶向测序检测到的体细胞变异开发探索性CR预测模型。此外，研究还探讨了临床和基因组因素对无复发生存期（recurrence-free survival, RFS）和总生存期（overall survival, OS）的预后意义。

二、研究设计与关键方法

该研究为一项回顾性、单中心观察性研究，经机构审查委员会批准（IRB No: UC19EESE0127）。研究最初考虑四种癌症类型，2014年至2020年间共有91例患者初步符合纳入条件，其中3例食管癌和11例胃癌患者因治疗目的为姑息性而被排除，最终纳入77例以根治为目的治疗的患者，包括食管鳞状细胞癌（ESCC，n = 23）、非HPV相关头颈部鳞状细胞癌（HNSCC，n = 24）和直肠腺癌（RAC，n = 30）。ESCC和HNSCC患者接受根治性放化疗（chemoradiation therapy, CRT）或放疗，RAC患者接受术前CRT后行根治性全直肠系膜切除术。

治疗反应评估基于治疗前后影像学检查。接受根治性CRT/RT的患者依据实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）1.1版评估；接受术前CRT/RT的患者依据手术标本病理分期评估。CR定义为完全肿瘤消退或病理结果为ypT0或ypTis且无残留转移淋巴结（ypN0）。最终将反应二分类为CR或non-CR。

研究人员采用包含161个基因的定制化panel进行靶向NGS，覆盖DNA损伤应答和修复通路（包括错配修复、核苷酸切除修复、同源重组修复、非同源末端连接和范可尼贫血通路），以及免疫相关、细胞因子相关和公认的癌症相关基因。测序在Illumina NovaSeq 6000平台完成，平均覆盖深度达3095.4×。由于缺乏配对正常组织，采用肿瘤-only模式进行变异检测，并使用内部正常panel降低噪声。通过严格过滤标准确保高置信度变异。KEGG通路和基因本体（Gene Ontology, GO）分析使用Metascape进行。预测模型采用多变量逻辑回归，通过10折交叉验证评估性能。

三、研究结果

3.1 患者特征

研究队列共77例患者，其中男性61例（79.2%），女性16例（20.8%）。治疗后25例（32.5%）达到CR，52例（67.5%）归为非CR。全队列中位年龄68岁，CR组（中位69岁，范围57–85）显著年长于non-CR组（中位65.5岁，范围44–81；P = 0.015）。临床T和N分期分布、性别、组织学类型、生物有效剂量（biologically effective dose, BED）和同期化疗在两组间无显著差异。non-CR组的复发率（29/52, 55.8%）显著高于CR组（7/25, 28.0%；P = 0.022）。

3.2 基因组图谱与反应相关变异

靶向深度测序共在153个基因中鉴定出1263个非同义突变。全队列中最常见的突变基因为^TP53（70.1%）、^APC（41.6%）、^NOTCH1（41.6%）、^KMT2C（39.0%）、^NOTCH3（36.4%）和^NOTCH2（35.1%）。CR与non-CR组间的体细胞突变总数无显著差异（P = 0.130），但在单个基因水平上存在显著差异。单变量分析显示六个基因与放疗反应显著相关：^APC（P = 0.008, OR = 4.32）、^KRAS（P = 0.012, OR = 9.73）和^KMT2C（P = 0.018, OR = 3.70）突变在non-CR组显著富集；^CD274（P = 0.003, OR = 0.05）、^MSH3（P = 0.011, OR = 0.06）和^NOTCH3（P = 0.048, OR = 0.37）突变在CR组更常见。配对分析显示，^APC–^KMT2C、^APC–^KRAS和^KMT2C–^KRAS共变异在non-CR组中更频繁。所有^KRAS变异均发生于RAC，且non-CR组中16例^APC–^KMT2C共变异中的12例也见于RAC。^CD274和^MSH3变异仅见于CR组但频率较低。

在变异水平上，non-CR组以肿瘤抑制基因和表观遗传调控基因的功能缺失（loss-of-function, LoF）突变富集为特征。^APC变异多为截短突变，提示^APC失活可能与放疗敏感性降低相关。^KRAS突变集中于致癌热点（p.G12D和p.G13D），主要见于RAC患者。CR组则具有涉及免疫调节和DNA修复基因的独特突变谱，^CD274（PD-L1）和^MSH3的所有突变均仅在该组发现。

3.3 功能富集与通路分析

通路富集分析显示，CR组显著富集与活跃细胞更新相关的通路，如“细胞群体增殖”和“生长”，提示基线增殖活性较高的肿瘤可能对电离辐射的DNA损伤效应更敏感。non-CR组则以治疗逃避和存活相关通路富集为特征，“癌症通路”和“EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药”是最显著过表达的条目。此外，non-CR组中“DNA修复”和“铂类药物耐药”通路的富集为放疗反应降低提供了基因组背景。三种肿瘤类型分别进行通路分析时，“癌症通路”和“MAPK级联调控”在所有三种类型中均富集，其余富集条目因肿瘤类型而异。

3.4 预后因素

单变量Cox回归分析显示，同期化疗和治疗反应两个临床变量与RFS显著相关，另有十种基因组变异（^CCND1、^CTNNB1、^CXCL9、^ERCC6、^FANCD2、^LIF、^MIEN1、^PDCD1、^RAD51B和^SLC2A3）与较差RFS显著相关。多变量分析中，^CCND1（HR = 5.44）、^CXCL9（HR = 579.59）、^ERCC6（HR = 5.07）、^LIF（HR = 4.80）和^RAD51B（HR = 6.81）变异仍为RFS较差的独立预后因素。相反，同期化疗（HR = 0.12）被确认为RFS的独立有利预后因素。

3.5 整合临床与基因组模型预测放疗反应

研究人员从单变量比较中筛选候选预测因子，选择以68岁为分界值的年龄作为临床预测因子，六个反应相关基因组变量（^APC、^CD274、^KMT2C、^KRAS、^MSH3和^NOTCH3）作为基因组预测因子。整合模型同时纳入年龄和六个基因组变量进行多变量逻辑回归。10折交叉验证结果显示，整合模型性能最佳，CV-AUC为0.867，灵敏度94.0%，准确率82.9%。临床模型和基因组模型的CV-AUC分别为0.632和0.864。最终预测公式为：z = ?0.862 + (0.281 × 年龄≥68岁状态) ? (0.381 × ^APC状态) + (20.241 × ^CD274状态) ? (2.123 × ^KMT2C状态) ? (2.147 × ^KRAS状态) + (19.820 × ^MSH3状态) + (1.641 × ^NOTCH3状态)，P(CR) = 1/(1 + exp(?z))。基于约登指数确定的最优概率阈值为0.328，此时AUC为0.881，灵敏度76.0%，特异度86.5%，总体准确率83.1%。将合并模型分别应用于ESCC、HNSCC和RAC时，AUC分别为0.964、0.829和0.906。

四、讨论与结论

研究讨论部分指出，^APC、^KRAS和^KMT2C突变在non-CR组中更常见，提示其可能与放疗反应降低相关。^KRAS突变集中于典型热点（p.G12D/G13D），主要见于RAC，提示组成性RAS-MAPK信号可能促进放疗抵抗。^KMT2C变异与放疗反应关联的直接证据有限，但一项III期非小细胞肺癌放化疗研究将^KMT2C/^KMT2D变异鉴定为局部控制和生存的负性预测因子。^APC变异富集可能反映Wnt/β-catenin通路失调，该通路与直肠癌新辅助放化疗反应不良相关，^APC可能标记谱系相关的Wnt驱动抵抗表型而非普遍的放疗抵抗机制。

CR相关变异方面，^MSH3与CR的关联提示DNA修复相关脆弱性可能影响放疗反应。^CD274变异全部见于CR肿瘤，与直肠癌中免疫活跃反应状态一致。关于^NOTCH3，结果方向与既往通路水平研究一致，但实验研究显示放疗诱导的Notch激活促进放射抵抗，这种差异可能源于通路水平改变与单基因事件不等价、^NOTCH3突变不一定代表通路激活、以及肿瘤类型和组织背景的差异。

共变异模式应在肿瘤类型背景下解读。^APC–^KRAS和^KMT2C–^KRAS组合仅见于RAC，多数^APC–^KMT2C共变异也见于RAC，这些模式可能反映RAC的基因组背景而非三个基因间的功能性相互作用。

研究结论指出，该研究在包含ESCC、HNSCC和RAC的异质性队列中鉴定了与放疗反应相关的候选基因组特征。由于若干关键关联集中于RAC，合并的临床-基因组模型应被解释为该队列特异的，而非泛癌种预测因子。在临床应用前，需要在更大规模、独立且癌症类型特异的队列中进行验证。