《International Journal of Molecular Sciences》：Inflammatory Burden Shapes Antioxidant Adaptation and Immunometabolic Remodeling in LPS-Activated BV-2 Microglial Cells
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神经炎症是众多神经退行性疾病的标志特征，其特征为活化的小胶质细胞中发生深刻的炎症、代谢和氧化还原改变。尽管脂多糖（LPS）刺激的BV-2细胞是最广泛使用的体外神经炎症模型之一，但对该模型背后协调的分子适应的全面理解仍不完整。本研究旨在表征暴露于100 ng/m
神经炎症是众多神经退行性疾病的标志特征，其特征为活化的小胶质细胞中发生深刻的炎症、代谢和氧化还原改变。尽管脂多糖（LPS）刺激的BV-2细胞是最广泛使用的体外神经炎症模型之一，但对该模型背后协调的分子适应的全面理解仍不完整。本研究旨在表征暴露于100 ng/mL LPS 24 h的BV-2细胞的蛋白质组重塑，并探究在不同水平LPS暴露下抗氧化反应与炎症反应之间的关系。蛋白质组学分析鉴定出89种差异表达蛋白，涉及细胞骨架组织、网格蛋白介导的内吞作用、溶酶体功能、免疫代谢和氧化还原调节。验证实验证实了细胞骨架和内吞蛋白的变化，包括波形蛋白（Vimentin）、凝溶胶蛋白（Gelsolin）、Disabled同源物2（Disabled homolog-2）和网格蛋白轻链A（clathrin light chain A），同时伴随溶酶体途径相关蛋白的调节以及免疫代谢酶乌头酸脱羧酶1（aconitate decarboxylase 1）的显著诱导。功能富集分析确定核因子E2相关因子2（NRF2）是被最显著激活的上游调节因子，这一预测与适应性抗氧化程序的参与一致。有趣的是，对递增LPS浓度的分析显示，抗氧化反应与炎症刺激并不成比例。由NRF2控制的抗氧化酶的表达在LPS浓度高达500 ng/mL时逐渐增加，但在1000 ng/mL LPS时下降，而促炎介质则持续上调。该模式与在所测试的最高炎症负担下抗氧化适应的减弱相一致。总之，这些发现表明BV-2/LPS模型的特征在于炎症、氧化还原、代谢、溶酶体、内吞和细胞骨架途径之间的动态相互作用，为该神经炎症模型的解释和实验应用提供了更全面的表征。
研究背景与科学问题
神经炎症是中枢神经系统（CNS）内的复杂动态过程，急性且受控的神经炎症有助于维持CNS稳态和组织修复，而慢性或失调的神经炎症反应则是神经退行性疾病进展的关键驱动因素。小胶质细胞作为CNS驻留的免疫细胞，在生理状态下呈监视表型，受到病原体、损伤或内源性危险信号刺激后迅速转变为活化表型，分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和活性氧（ROS）等炎症介质。脂多糖（LPS）通过与CD14/MD2/TLR4受体复合物结合，激活NF-κB等多条胞内信号通路，是体外研究小胶质细胞炎症活化最广泛使用的实验刺激物。LPS刺激的下游后果之一是氧化应激，ROS和活性氮（RNS）的产生增加会放大炎症信号并导致神经元损伤。为对抗氧化损伤，细胞激活转录因子核因子E2相关因子2（NRF2），其调控血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶-1（NQO1）等多种抗氧化和细胞保护基因。然而，尽管已知炎症与氧化应激之间存在相互影响，但随着炎症活化逐步加剧，抗氧化适应如何演变尚不清楚。因此，研究人员开展此项研究，首先通过蛋白质组学分析表征BV-2小胶质细胞在100 ng/mL LPS处理24小时这一常用参考条件下的分子重塑，再通过浓度-反应实验考察不同LPS暴露水平下抗氧化反应与炎症反应的关系。
研究方法概述
研究人员采用二维电泳（2DE）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析，以鉴定LPS处理前后BV-2细胞的差异表达蛋白。利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行功能富集分析和上游调节因子预测。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）检测mRNA水平变化，并通过免疫印迹法（Western blotting）验证选定蛋白的表达。此外，采用MTT法评估细胞代谢活性，使用DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS水平，利用Griess试剂检测一氧化氮（NO）释放量。所有实验均基于小鼠BV-2小胶质细胞系（由意大利摩德纳-雷焦艾米利亚大学Elisabetta Blasi教授惠赠）。
研究结果
2.1 差异蛋白表达分析
经LPS处理后，共鉴定出101个差异表达蛋白点，合并为89种蛋白，其中66个上调、35个下调（p值<0.05，倍数变化≥1.5）。IPA分析预测NRF2为最显著活化的上游调节因子（z-score=2.917，p=2.74×10-17），并与22种蛋白相关，表明存在旨在限制LPS损伤的代偿性反应。同时预测白细胞介素-15（IL-15）被激活（z-score=2.02），可能增强促炎信号。
2.2 蛋白质组结果的验证
LPS处理显著降低了波形蛋白（VIM）和凝溶胶蛋白（GSN）的mRNA及蛋白水平，表明细胞骨架重塑。内吞相关蛋白Disabled同源物2（DAB2）和网格蛋白轻链A（CLTA）的mRNA和蛋白水平也显著降低，提示网格蛋白介导的内吞作用（CME）机制发生重塑。溶酶体相关蛋白ATP酶H+转运V1亚基E1（ATP6V1E1）、组织蛋白酶A（CTSA）和β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）的mRNA水平在24小时显著升高，表明溶酶体途径在炎症后期被激活。代谢酶方面，转醛醇酶1（TALDO1）的mRNA在24小时显著上调；嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的mRNA在3小时短暂升高；苹果酸脱氢酶2（MDH2）蛋白在24小时增加；乌头酸脱羧酶1（ACOD1）的mRNA和蛋白均在3小时和24小时显著升高，表明免疫代谢重塑，特别是衣康酸途径的快速启动。
2.3 不同LPS浓度对细胞代谢活性的影响
LPS以浓度依赖方式降低MTT还原能力，从50至500 ng/mL逐渐下降，在500至1000 ng/mL间趋于平台。
2.4 不同LPS浓度对ROS产生的影响
在所有测试浓度下，LPS均显著增加细胞内ROS水平，且从50至1000 ng/mL呈渐进性上升趋势，确认了氧化应激的诱导。
2.5 不同LPS浓度对抗氧化反应相关基因和蛋白表达的影响
在50至500 ng/mL范围内，LPS增加了Nfe2l2及其下游抗氧化酶（如Sod2、Nqo1、Gsr、Gpx1、Prdx1）的转录本水平。然而，在1000 ng/mL时，上述多个基因的表达较500 ng/mL显著降低，呈现非线性的剂量-反应模式。蛋白水平的趋势与转录水平基本一致，但统计显著性较弱。超氧化物歧化酶1（SOD1）在各浓度组均呈轻微下降。
2.6 不同LPS浓度对一氧化氮释放及炎症相关基因和蛋白表达的影响
促炎基因（Nos2、Nlrp3、Ptgs2、Il1b、Tnf、Il6）的表达在所有LPS浓度下均持续上调，包括1000 ng/mL。NO释放也随LPS浓度升高而增加。抗炎细胞因子Il4的表达则普遍降低。iNOS、NLRP3和COX-2的蛋白水平呈浓度依赖性升高，其中iNOS和COX-2在500和1000 ng/mL时才达到统计显著。
讨论与结论
讨论部分指出，蛋白质组学数据揭示了LPS激活的BV-2细胞在细胞骨架、内吞、溶酶体、代谢和氧化还原等多个层面的系统性重塑。细胞骨架蛋白VIM和GSN的减少反映了活化后期的结构状态；内吞蛋白DAB2和CLTA的下调可能影响TLR4信号的持续时间和区室化；溶酶体相关蛋白的延迟诱导提示在持续炎症活化下，细胞需增强受损成分的周转和降解能力。ACOD1的早期和持续上调表明衣康酸途径快速参与，可能作为负反馈机制限制过度炎症并支持抗氧化适应。浓度-反应实验的关键发现是，促炎介质和氧化标志物随LPS浓度升高持续上调，而多种抗氧化酶的表达在500 ng/mL时达峰，在1000 ng/mL时反而显著降低，表明在高炎症负担下选择性抗氧化适应减弱，而非抗氧化防御的全面失效。研究结论强调，不同的LPS浓度可能代表生物学上截然不同的实验状态，在使用BV-2/LPS模型时应谨慎考虑炎症刺激的强度。
