《International Journal of Molecular Sciences》：TOP2A Overexpression as a Prognostic Biomarker in High-Grade Meningioma: An Integrated Single-Cell and Bulk Transcriptomic Study
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虽然先前的单细胞研究已鉴定出增殖性肿瘤亚群，但TOP2A局部拷贝数状态的预后及治疗意义尚未明确。本研究旨在通过整合单细胞与批量转录组学分析，描绘高级别脑膜瘤的细胞结构，并评估TOP2A表达及其局部拷贝数状态的临床与预后意义。研究人员在探索性队列中整合了单细胞R
虽然先前的单细胞研究已鉴定出增殖性肿瘤亚群，但TOP2A局部拷贝数状态的预后及治疗意义尚未明确。本研究旨在通过整合单细胞与批量转录组学分析，描绘高级别脑膜瘤的细胞结构，并评估TOP2A表达及其局部拷贝数状态的临床与预后意义。研究人员在探索性队列中整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）与批量RNA测序（bulk RNA-seq）以解析高级别脑膜瘤的细胞景观，随后进行了功能性亚群鉴定、差异表达分析和生存分析。TOP2A被优先进行多水平验证：在独立批量队列中确认mRNA过表达，通过免疫组织化学（IHC）确认蛋白过表达，并通过荧光原位杂交（FISH）确认局部基因拷贝数状态。研究人员采用Kaplan–Meier生存分析评估患者预后，并使用Spearman秩相关系数评估连续变量间的相关性。探索性高级别队列的scRNA-seq揭示了一个以TOP2A高表达为特征的细胞周期增殖簇。在包含160个样本的批量RNA-seq队列中，TOP2A在高分级和复发肿瘤中过表达，且TOP2A mRNA升高与较短的无进展生存期（PFS）显著相关。对154份标本的IHC证实了TOP2A蛋白过表达，对27份标本的FISH显示TOP2A局部拷贝数增加富集于高级别病例。拷贝数增加与TOP2A mRNA水平一致。尽管TOP2A mRNA和蛋白过表达均与较短的PFS相关，但FISH子集样本量有限，无法按拷贝数状态进行独立生存分析。本研究确定TOP2A mRNA和蛋白过表达是高级别脑膜瘤的预后生物标志物，并显示TOP2A局部拷贝数增加富集于高级别肿瘤且与TOP2A表达一致。通过整合转录过表达与拷贝数增加，研究结果将TOP2A确定为候选预后生物标志物，值得在高级别脑膜瘤中进行前瞻性评估。
脑膜瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占所有原发性脑肿瘤的37%，全球年龄标准化年发病率为每10万人1.3至7.8例。根据2021年世界卫生组织（WHO）分类，中枢神经系统WHO 1级肿瘤占80.1%，2级占18.3%，3级占1.5%。当前脑膜瘤治疗策略在不同疾病阶段面临不同挑战：良性WHO 1级肿瘤完全手术切除治愈率超过90%，放疗或立体定向放射外科对不可切除或残留病灶可提供80–90%的10年局部控制率，但高级别或复发性脑膜瘤因侵袭性生物学行为和高复发率而难以处理。全身性药物研发进一步受到肿瘤细胞结构和免疫微环境认知不足以及缺乏阳性随机对照试验的阻碍。尽管采用最大安全切除联合辅助放疗，WHO 2级和3级脑膜瘤患者预后仍显著较差，5年无进展生存率分别降至48%和13%，而复发性高级别肿瘤常表现出治疗抵抗，多次复发后中位总生存期不足2年。因此，阐明脑膜瘤的分子图景成为解决未满足治疗需求的关键。单细胞测序等近期技术进步推动了肿瘤微环境（TME）研究，通过生成肿瘤标本的高分辨率图谱，促进瘤内异质性的系统表征，并阐明细胞成分的组成结构和分子景观。
近期单细胞和空间转录组研究推进了对脑膜瘤细胞异质性的理解。值得注意的是，已有研究在非典型和过渡型脑膜瘤中鉴定出MKI67/TOP2A阳性的增殖性肿瘤亚群，一项大规模多组学研究定义了与进展和结局相关的细胞状态。然而，TOP2A局部拷贝数状态的预后意义及其治疗意义尚未明确。在本研究中，研究人员将整合的单细胞和批量转录组方法应用于高级别脑膜瘤标本，并对TOP2A进行了多水平验证——包括mRNA过表达、蛋白过表达和局部基因拷贝数增加——以评估其作为候选预后和治疗生物标志物的潜力。研究人员鉴定了与恶性进展相关的不同细胞亚型和分子特征，并提供基于FISH的证据表明局部TOP2A拷贝数增加富集于高级别肿瘤且与TOP2A mRNA表达一致。总体而言，这些结果为TOP2A指导的风险分层和发现脑膜瘤定向治疗靶点建立了框架。
研究人员在探索性队列中通过单细胞表征揭示了高级别脑膜瘤的细胞和功能结构。对两例患者肿瘤标本进行scRNA-seq，共获得25,635个单细胞，经UMAP降维后分为六个主要细胞谱系：肿瘤细胞、巨噬细胞、T细胞、周细胞、中性粒细胞和肥大细胞。CNV分析确认了肿瘤区的恶性身份。通过基因集变异分析（GSVA）对肿瘤细胞进行功能分层，得到六个功能亚群：细胞周期增殖、MYC驱动增殖、血管生成、间充质激活程序、MYC靶点和脂质代谢。其中细胞周期增殖亚群的头号标志基因是TOP2A（按log2倍数变化排序）。由于该两例scRNA-seq队列设计为探索性、假设生成的图谱，这些观察随后在独立批量转录组队列中进行了验证。
在批量RNA测序队列中，研究人员对160份有临床注释的脑膜瘤标本（包括117例WHO 1级、38例2级和5例3级）进行了测序。差异表达分析在1级与2–3级肿瘤之间鉴定出359个差异表达基因（DEGs）（300个上调，59个下调）。GO和KEGG富集分析显示神经活性配体-受体相互作用、肌肉系统过程和DNA复制通路显著扰动。将359个批量DEGs与肿瘤细胞区室前50个标志基因取交集，得到11个重叠基因。对这11个候选基因进行无进展生存期（PFS）的单变量Cox回归分析。基于两个互补标准优先选择TOP2A：首先，其风险比（HR = 1.763）在11个基因中排名第二，但HR最大的LINC01524以及统计显著性排名靠前的CHP2和C5orf66-AS1在批量数据中接近检测不到；在全部154个样本中检出的候选基因（TOP2A、BIRC5和SLC6A1）中，TOP2A与BIRC5的关联无统计学差异。其次，TOP2A因其已确立的可成药性（是已批准的拓扑异构酶II抑制剂的直接靶点）以及已有验证的IHC和FISH检测方法而被选中。临床亚组分析显示，TOP2A在高级别肿瘤（2–3级）和复发肿瘤中表达显著升高，而在颅底与非颅底肿瘤之间无显著差异，交通性肿瘤仅呈趋势但多重校正后不显著。在154例有随访数据的患者中，TOP2A mRNA高表达（log2 > 9.2503）与显著较短的无进展生存期相关（中位24.0个月 vs. 未达到；HR = 8.79，95% CI 3.45–22.41；log-rank p = 4.7×10
-8，Lausen–Schumacher校正p = 3.0×10
-6）。单变量Cox分析显示TOP2A mRNA高表达与较短PFS显著相关（HR = 1.76 per log2单位，p = 5.6×10
-6）；多变量模型中，调整初发状态和Simpson分级后TOP2A mRNA仍是PFS的独立预测因子（HR = 1.54，95% CI 1.20–1.98，p = 6.4×10
-4），模型C-index = 0.887。当TOP2A与Ki-67同时纳入模型时，TOP2A保留独立关联（HR = 1.42，p = 1.1×10
-2），而Ki-67不独立（p = 0.218）；加入TOP2A显著改善模型拟合（似然比检验p = 7.7×10
-3，ΔAIC = ?5.10，连续NRI = +0.79），但未进一步改善区分度（ΔC-index = ?0.002）。多种变量选择策略均收敛于相同模型。敏感性分析中强制纳入多个协变量后TOP2A仍独立显著（HR = 1.65，p = 2.6×10
-3）。这些结果表明TOP2A过表达是脑膜瘤PFS的独立不良预后因素。
研究人员对同一患者队列中154份有匹配批量RNA-seq数据的石蜡包埋（FFPE）标本进行了免疫组织化学（IHC）检测。代表性图像显示高级别肿瘤核染色强度明显强于低级别肿瘤。定量IHC评分显示，高级别（2–3级）肿瘤、临床交通性亚型和复发病例中TOP2A蛋白水平显著升高。147例有随访数据的患者按最佳截断值分层后，高TOP2A蛋白水平与较短PFS显著相关（log-rank p = 1.75×10
-6，校正后p = 9.1×10
-5）。单变量Cox回归证实了该关联（高vs.低：HR = 8.57，95% CI 3.00–24.51，p = 6.2×10
-5；连续变量：HR = 1.11，p = 3.3×10
-6）。蛋白高表达组mRNA水平显著更高（p = 1.6×10
-12），Spearman相关分析证实mRNA与蛋白表达正相关（r = 0.65，95% CI 0.54–0.74，p = 3.8×10
-19）。
研究人员采用双色荧光原位杂交（FISH）对27份新鲜冷冻脑膜瘤标本直接量化TOP2A局部拷贝数，使用TOP2A特异性探针和17号染色体着丝粒（CSP27）参考探针。定量FISH分析显示，2–3级肿瘤的TOP2A/CSP27比值显著高于1级肿瘤（p = 3.35×10
-3，校正后q = 0.01005）。临床交通状态和颅底受累亚组间无显著差异。FISH高组（比值≥1.5，n = 8）的TOP2A mRNA水平显著高于FISH低组（比值<1.5，n = 19）（p = 0.0135），且TOP2A/CSP27比值与mRNA表达呈正相关（r = 0.49，95% CI 0.13–0.74，p = 0.0090）。
讨论部分指出，脑膜瘤存在显著的瘤内异质性，功能状态而非单纯形态异质性驱动临床差异。研究观察到高表达TOP2A的细胞周期增殖簇，将单细胞观察扩展到批量转录组水平后，发现TOP2A表达富集于高级别病例，且高mRNA水平与较短PFS显著相关。与既往研究相比，本研究在更大临床队列中从mRNA、蛋白和拷贝数水平表征了TOP2A。TOP2A的跨平台一致性——mRNA和蛋白过表达伴随局部拷贝数增加——支持其作为候选生物标志物。相对于Ki-67，TOP2A提供了统计学上显著的额外预后信息，但未改善区分度，因此应视为互补标志物而非替代。TOP2A扩增在乳腺癌中预示对蒽环类方案的化疗敏感性，在侵袭性前列腺癌中高表达被用于合理化联合策略（如依托泊苷联合EZH2抑制）。本研究通过证明高级别病例中TOP2A局部拷贝数增加，支持其作为候选预后生物标志物的潜力，并提示未来需前瞻性研究评估TOP2A拷贝数状态能否指导风险适应性治疗策略。
研究局限性包括：单细胞部分仅基于两例复发性高级别肿瘤，结论为探索性；3级肿瘤数量少（批量队列160例中5例，IHC队列154例中4例），因此2级和3级合并分析；预后分析受限于进展事件数量（154例中19例，12.3%），限制了可可靠建模的协变量数量。未来研究应优先扩大单细胞图谱至更大规模、未治疗队列，并整合空间技术以绘制增殖克隆与微环境之间的拓扑关系。
结论部分总结：本研究整合单细胞和批量转录组学与多水平实验验证，探索了脑膜瘤的分子结构。核心发现是TOP2A mRNA和蛋白过表达与较短无进展生存期相关，而FISH检测的TOP2A局部拷贝数增加富集于高级别病例且与TOP2A表达一致；FISH子集样本量有限，无法进行独立生存分析。这些发现支持在高级别脑膜瘤中进行TOP2A指导的风险分层和TOP2A定向治疗策略的合理性。
