基于基因组信息的环介导等温扩增（LAMP）检测与区分青枯雷尔氏菌（Ralstonia pseudosolanacearum）演化型I和III的现场诊断方法开发与验证

《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Informed Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for Detection and Differentiation of Ralstonia pseudosolanacearum Phylotypes I and III

　　

：青枯菌种复合群（RSSC）可引起多种重要经济作物的细菌性枯萎病。RSSC已被重新分类为三个种，其中属于演化型IIB的R. solanacearum sequevars 1和2在美国被指定为选择性病原体（Select Agents）。许多针对“R. solanacearum”的快速检测方法靶向整个RSSC，因此会与美国本土流行的R. pseudosolanacearum发生交叉反应。为避免假阳性鉴定和不必要地触发选择性病原体应对措施，研究人员开发并验证了四种便携式LAMP筛查检测变体，用于特异性检测R. pseudosolanacearum：用于检测R. pseudosolanacearum的实时LAMP检测（1），以及在AmpliFire?等温荧光计（2）或Genie? III（3）中区分R. pseudosolanacearum演化型I和III的实时LAMP检测，以及用于检测R. pseudosolanacearum的比色LAMP检测（4）。所有检测均表现出高灵敏度（10–50菌落形成单位（CFU）/反应）和高特异性；基于177株RSSC分离株（81株演化型I、70株演化型II、15株演化型III和11株演化型IV）及53株相关宿主和土壤中的非RSSC细菌病原体，分析特异性与选择性均为100%；基于接种植物和Euphresco样本组的检测，诊断特异性和灵敏度均为100%。本文所述检测方法是有用的诊断工具，可部署于现场，以支持国内调查和检测工作。

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一、研究背景与问题

青枯菌种复合群（Ralstonia solanacearum species complex，RSSC）是一类能够侵染多种重要经济作物并引发细菌性枯萎病的植物病原菌群。该复合群依据16S–23S核糖体内部转录间隔区（ITS）的系统发育分析被划分为四个主要演化型（phylotype），其中演化型I起源于亚洲，演化型II起源于美洲，演化型III起源于非洲及印度洋地区，演化型IV起源于澳大利亚、印度尼西亚和日本。近年来，这些演化型被重新归类为三个物种：R. pseudosolanacearum（演化型I和III）、R. solanacearum（演化型II）和R. syzygii（演化型IV）。在美国，R. solanacearum演化型IIB的sequevars 1和2（历史上称为Race 3 biovar 2，R3b2）被列为严格管制的选择性病原体（Select Agent），一旦检出即需触发高度监管措施。然而，目前广泛使用的ImmunoStrip?快速检测试纸条针对的是整个RSSC，因此会与美国本土流行的R. pseudosolanacearum（演化型I）发生交叉反应，导致假阳性鉴定和不必要地触发选择性病原体应对程序。此外，尽管演化型I菌株在美国已有报道，演化型III菌株在美国仍属外来病原体，尚无针对R. pseudosolanacearum演化型III的检测方法见诸文献。全球贸易和人员流动加速了病原体的跨区域传播，演化型III菌株对其他国家农业的潜在影响尚不明确。因此，亟需开发一种能够特异性检测所有R. pseudosolanacearum（演化型I和III）并区分这两个演化型的现场可部署检测方法，以支持美国的监测与检疫工作，同时保障安全贸易。

二、研究内容与结论

研究人员通过比较基因组学分析，在R. pseudosolanacearum全基因组范围内筛选特异性靶标基因。分析鉴定出151个为所有R. pseudosolanacearum（演化型I和III）所独有的基因，以及分别844个和886个为演化型I和演化型III所独有的基因。然而，由于演化型I和III之间存在序列差异，单一通用靶标难以设计出合适的LAMP引物。研究人员转而采用“双联”（duplex）策略，将演化型I特异性标记和演化型III特异性标记混合于同一反应体系中。最终，一个演化型I特异性靶标——功能未知的保守蛋白（conserved protein，CP，基因座标签RSc1496），以及一个演化型III特异性靶标——假定蛋白（hypothetical protein，HP，基因座标签PG907_RS00100），被确定为有效的诊断标记并用于后续检测开发。基于这两个靶标，研究人员开发并验证了四种LAMP检测变体：检测所有R. pseudosolanacearum的实时LAMP检测（Assay 1）、在AmpliFire?等温荧光计中区分演化型I和III的实时LAMP检测（Assay 2）、在Genie? III中区分演化型I和III的实时LAMP检测（Assay 3），以及检测所有R. pseudosolanacearum的比色LAMP检测（Assay 4）。这些检测方法均表现出高灵敏度和高特异性，为现场快速诊断提供了可靠工具。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：其一，比较基因组学分析，利用MicroScope微生物基因组注释与分析平台对12株RSSC菌株及288株近缘物种的基因组进行注释和直系同源基因比较，并通过BLASTn对本地375株Ralstonia基因组数据库进行特异性筛选；其二，LAMP引物设计，使用PrimerExplorer V5软件针对CP和HP靶标设计引物，并通过NCBI Primer-BLAST和BLASTn进行计算机模拟特异性评估；其三，多种LAMP检测格式的建立，包括实时荧光LAMP和比色LAMP，适配不同便携式仪器；其四，全面的验证测试，包括分析特异性与灵敏度、诊断特异性和灵敏度、重复性和精密度测试，以及Euphresco国际实验室间比较（ILC）样本组的盲测验证。样本来源涵盖177株RSSC分离株（81株演化型I、70株演化型II、15株演化型III和11株演化型IV）、53株非RSSC细菌病原体、健康植物组织DNA，以及来自美国和关岛的34份诊断样本。

四、研究结果

2.1 靶标鉴定：比较基因组分析鉴定出151个R. pseudosolanacearum（演化型I和III）独有基因，以及分别844和886个演化型I和III独有基因。经筛选，CP（保守蛋白）被确定为演化型I特异性诊断标记，HP（假定蛋白）被确定为演化型III特异性诊断标记。

2.2 检测灵敏度：使用纯化DNA检测时，检测限（LoD）因菌株而异，约为80–1300基因组当量拷贝（GEC）/反应。使用热裂解细胞悬液检测时，灵敏度提高约100倍，演化型I菌株202402-02和演化型III菌株UW685的LoD分别低至约10 CFU/反应和约20 CFU/反应。宿主化合物对检测灵敏度基本无影响，仅天竺葵渗出液使LoD略有升高（50–250 CFU/反应和约40 CFU/反应）。

2.3 检测特异性：基于177株RSSC分离株和53株非RSSC细菌病原体的测试，所有检测均表现出100%的分析特异性和选择性。有九株演化型II菌株产生晚期阳性信号，经多种独立检测方法证实为演化型I菌株的污染所致，而非检测方法的交叉反应。

2.4 诊断灵敏度和特异性：34份诊断样本（22份含R. pseudosolanacearum，12份含R. solanacearum）的测试显示，所有检测均表现出100%的诊断灵敏度和特异性。来自关岛和夏威夷的病茄子和番茄样本的检测结果与16S PCR和egl测序结果一致。

2.5 检测精密度：三名操作人员在三种不同仪器上对盲测样本组的测试结果完全一致（N=9），证明了检测方法的重复性和精密度。

2.6 Euphresco样本：10份盲测样本和4份阳性对照的检测结果显示，所有检测均能准确识别含R. pseudosolanacearum的样本，并正确区分演化型I和III。

2.7 接种植物样本：接种UW685（演化型III）的天竺葵和马铃薯产生的症状组织均呈阳性结果，且正确鉴定为演化型III。部分无症状植物也检测出阳性结果。玫瑰样本存在抑制问题，经DNA清洁处理后可获得阳性结果。

2.8 合成对照：CP和HP合成gBlocks?对照在100 ag/μL浓度下均可被所有检测识别。建议HP对照用于所有检测，CP对照作为实时检测Assay 2和3的第二个独立对照。

五、讨论与结论

讨论部分指出，现有文献中虽有检测R. pseudosolanacearum演化型I的LAMP方法，但均存在不同程度的假阴性问题，且无针对演化型III的检测方法。本研究所开发的检测方法通过基因组比较分析鉴定了新型特异性靶标，克服了以往方法的局限性。研究还发现，热裂解细胞悬液的灵敏度显著高于纯化DNA，推测可能与粗提物中RNA的存在或LAMP试剂对粗提物的适应性有关，但确切机制尚未证实。演化型III sequevar 23菌株同时含有CP和HP两个靶标基因，但在双联检测中高浓度下优先产生演化型III信号，这符合其演化型III的分类归属。针对玫瑰等富含抑制物的样本，研究人员开发了一种适配现场的DNA清洁方法，能够有效去除抑制物并实现LAMP阳性检测。研究结论部分指出，本文所述检测方法经验证符合预期用途，所有检测均表现出高灵敏度和高特异性，能够检测接种植物样本中的病原体，包括有症状和无症状样本。四种检测变体为终端用户提供了多种选择，可根据需求选择仅检测R. pseudosolanacearum或区分演化型I和III，并适配两种不同的便携式仪器。这些检测方法是有用的诊断工具，可部署于现场以支持国内调查和检测工作。然而，与任何检测方法一样，随着新菌株的出现，应持续监测这些检测方法的性能，尤其是特异性方面。