《International Journal of Molecular Sciences》：NEMUCO: The In Vitro 4D NMJ as an Innovative Powerful Tool to Study Nerve and Muscle Cell–Cell Communication
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慢性肌肉卸载，无论是由于失神经支配、衰老、疾病、长期卧床（作为太空飞行的地面模拟或实际太空飞行任务），均会导致神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）的结构和功能衰退，进而引起肌肉质量下降和精细运动控制受损。类似的改变也在多种神经肌
慢性肌肉卸载，无论是由于失神经支配、衰老、疾病、长期卧床（作为太空飞行的地面模拟或实际太空飞行任务），均会导致神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）的结构和功能衰退，进而引起肌肉质量下降和精细运动控制受损。类似的改变也在多种神经肌肉疾病和肌病的运动控制障碍症状中被观察到。本研究报道了一个强大的三维（3D）共培养实验模型，该模型能够发育出类似NMJ的结构，作为一种新颖的体外平台，用于基础与转化研究中的时间依赖性（四维，4D）功能/调控研究。将小鼠神经细胞（NSC-34运动神经元）和肌肉细胞（C2C12成肌细胞）共培养物（简称NEMUCO）分别培养在合成或生物来源的三维支架上。通过对细胞-细胞接触区域进行三维重建获得的形态学分析显示，NSC-34运动神经元与C2C12肌管之间存在紧密并列关系。研究人员进一步利用一系列分子与细胞生物学工具对共培养物进行了分析，这些工具基于NMJ特异性分子标记物的表达，并结合了肌肉和神经细胞特异性的分化生物标志物。从共培养的第2天开始，即可观察到特化的细胞-细胞接触。三重免疫荧光染色显示，在结蛋白（desmin）或快型肌球蛋白重链（fMyHC）阳性的发育中肌管上，呈现神经丝蛋白阳性的轴突末梢接近聚集的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）阳性的烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs），这代表了本体外系统中NMJ样结构组装的初步迹象。值得注意的是，共培养的运动神经元显示出SNAP-25（一种最重要的SNARE蛋白）转录水平的升高趋势，而共培养的肌管则表现出连接蛋白（junctophilin）和1型兰尼碱受体（ryanodine receptor type 1，RyR1）（两者均为分化肌纤维三联体连接的关键蛋白）转录水平的轻微增加。在大多数方面，本研究三维共培养体系中的神经元-肌管细胞-细胞接触模拟了天然突触前和突触后NMJ微域的特征。生长在三维支架上的神经元-肌管共培养物，为研究肌肉肌病中NMJ适应性和可塑性的分子机制提供了一个强大工具。此外，该方法还可被改造用于专为太空飞行条件下的细胞神经生物学研究设计的定制化微型化平台。
研究背景与目的
神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）是运动神经元与骨骼肌纤维之间特化的突触结构，负责将神经电信号转化为肌肉收缩反应。然而，在肌肉废用（如失神经支配、衰老、疾病、长期卧床或太空飞行）条件下，NMJ的结构与功能会发生显著衰退，导致肌肉萎缩和精细运动控制障碍。尽管NMJ的重要性已被广泛认知，但由于其高度复杂性以及体内研究的伦理和技术限制，尤其是在人类活体肌肉中进行药理学干预研究极为困难，因此，调控NMJ性能的潜在分子机制和信号通路在很大程度上仍未被阐明。为了克服这些挑战，建立一种可控的、能够模拟体内NMJ结构与功能的体外标准化实验模型显得尤为迫切。现有研究多采用二维（2D）共培养或诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官，但这些方法在重现性、标准化程度以及与真实生理环境的相似性方面仍存在不足。为此，研究人员开发并全面表征了一种名为NEMUCO的新型三维（3D）共培养模型，旨在提供一个更贴近生理状态的、可用于研究NMJ发育、成熟、可塑性及其在病理或特殊环境（如微重力）下适应性改变的强大体外平台。
关键技术方法概述
研究人员主要采用了以下关键技术方法来建立和分析NEMUCO模型：
- 1.
三维（3D）共培养体系构建：使用了两种不同类型的3D支架——合成的Alvetex?聚苯乙烯多孔支架和由I型胶原与Matrigel组成的生物水凝胶支架。将小鼠NSC-34运动神经元细胞系和小鼠C2C12成肌细胞系在上述支架上进行共培养，以促进细胞间相互作用和NMJ样结构的形成。
- 2.
高分辨率显微成像技术：应用激光共聚焦显微镜结合三维（3D）重建和去卷积算法（STED Xtend算法），对固定后的共培养细胞进行精细形态学分析。同时，采用微分干涉差（DIC）显微镜对活细胞进行实时观察，以捕捉细胞-细胞接触的动态过程。
- 3.
特异性分子标记物检测：通过免疫细胞化学（ICC）技术，使用针对神经丝蛋白（neurofilament）、结蛋白（desmin）、快型肌球蛋白重链（fMyHC）等神经和肌肉分化标志物的抗体，并结合α-银环蛇毒素（α-BTX）标记烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），来鉴定NMJ样结构的形成。
- 4.
分子生物学定量分析：运用蛋白质印迹法（Western blot）定量分析共培养体系中结蛋白（desmin）的表达水平变化。同时，采用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）检测与突触功能和肌肉兴奋-收缩耦联相关的关键基因，如SNAP-25、连接蛋白1（Jph1）和1型兰尼碱受体（RyR1）的转录水平。
研究结果
2.1 大鼠比目鱼肌原生NMJ
研究人员通过免疫荧光染色对大鼠比目鱼肌的原生NMJ进行了可视化，并将其作为后续体外实验的天然参照标准。
2.2 使用非经典（合成）和经典（生物）3D支架体外发育NMJ
研究人员建立了可靠的3D共培养方案，并在两种不同的3D支架上都观察到了处于不同发育阶段的NMJ样结构。
2.3 合成/Alvetex 3D支架上的神经与肌肉共培养
在Alvetex?聚苯乙烯支架上，共培养至第2-5天的细胞显示出轴突末梢接近预模式化的nAChRs簇，表明形成了发育中的细胞-细胞通讯接触。然而，该支架的不透明性限制了实时相差显微镜观察。
2.4 生物3D支架上的神经与肌肉细胞共培养
为解决合成支架中肌核数量少和肌管尺寸小的问题，研究人员采用由36% I型胶原和14% Matrigel组成的水凝胶支架。在此体系中，DIC显微镜清晰地展示了肌管的典型横纹模式和运动神经元轴突的生长。免疫细胞化学结果显示，被运动神经元接触的肌管展现出更好的细胞骨架和组织结构，形成了类似成人骨骼肌的横纹肌节样结构。更重要的是，该共培养物在CellBox-3硬件中也成功形成了细胞-细胞接触，验证了其用于太空实验的可行性。DIC成像还揭示了单个运动神经元可通过其分支轴突接触多个肌管，形成了类似运动单位的网络结构。
2.5 生物基质3D支架上不依赖神经接触的nAChRs聚类
研究发现，在没有运动神经元直接接触的情况下，肌管膜上也出现了nAChRs的模式化聚集，这可能是由于培养基中存在神经集聚蛋白（agrin）所致。
2.6 3D重建与形态学分析
通过激光共聚焦显微镜的z轴堆叠图像3D重建和去卷积分析，清晰地显示了NSC-34运动神经元与C2C12肌管之间的紧密并列关系，以及运动神经元的分支形态，验证了该模型能够模拟体内NMJ的形态特征。
2.7 蛋白质印迹分析
蛋白质印迹结果表明，与单独培养的肌管相比，共培养体系中的肌管其结蛋白（desmin）蛋白含量显著增加，这与共培养促进了肌源性活性增强的结论一致。
2.8 定量PCR（qPCR）基因表达分析
qPCR分析显示，在共培养体系中，肌管中编码三联体连接关键蛋白的Jph1和RyR1基因的转录水平略有升高。更为显著的是，共培养的运动神经元中编码突触前SNARE蛋白的SNAP-25基因的转录水平相比于单独培养提高了约20倍。这些转录调控变化与NMJ的成熟过程相一致。
讨论与结论总结
讨论部分：研究人员认为，所建立的NEMUCO模型是一个全新的、标准化的、高度可靠的工具，能够在体外模拟NMJ的结构发育和功能适应。该模型通过高分辨率显微技术和多种分子标志物（如SNAP-25/nAChR、Jph-1/RyR1）的检测，证实其能够复现神经肌肉突触形成的初始阶段（轴突生长、靶细胞接触）和随后的巩固过程。研究结果支持了“肌中心模型”，即nAChRs先在肌管膜上聚集，随后被神经末梢接近。共培养促进了肌管的成熟，表现为更高的结蛋白和fMyHC表达以及典型的横纹肌节结构。单个运动神经元与多个肌管接触的现象模拟了体内的运动单位。虽然受限于水凝胶基质无法获得电生理数据，但研究人员推测这些细胞-细胞接触可能具备功能性。与其他体外模型相比，NEMUCO在突触前和突触后的分辨率及综合表征方面具有优势。该模型被认为是研究NMJ在不同病理生理条件（如神经退行性疾病、自身免疫性疾病、氧化应激、微重力）下适应性和可塑性机制的可靠临床前平台。研究也指出了局限性，即该模型的使用时间有限，但其仍是动物模型的有力替代品。
结论部分翻译：鉴于对体外实验模型和组织工程方法日益增长的需求，特别是在生理学、病理生理学和药理学研究中，研究人员开发了一个强大且高度标准化的工具（3D神经与肌肉共培养，NEMUCO），用于研究随时间推移（第四维度，4D共培养）NMJ突触发生的结构和分子演化。该模型提供了对NMJ突触发生主要特征的更深入见解，从微观结构到潜在机制，这些都反映在明确的分子表达谱中，而这些分子表达谱在定义明确的3D体外培养条件下得以复现。NMJ的体外建模是研究导致突触前和突触后NMJ微域中关键分子亚细胞组织化的细胞、亚细胞和分子事件的有用工具，适用于从基础到临床研究实验室的各种实验环境。除了在特制生物芯片上生长的细胞模型外，本文报道的来源于特性明确的单细胞系的标准化3D神经元-肌肉共培养物，为研究调控突触发生、NMJ稳定性、适应性和可塑性的分子时空组装提供了一个可靠的研究平台。NEMUCO模型还可用于测试能够恢复各种神经退行性临床病症（包括重症肌无力等自身免疫性神经肌肉疾病）以及微重力和/或衰老过程中涉及肌肉活动改变的情况中受损NMJ传递的治疗性药理学方法或治疗方案。
