心肌细胞特异性修饰RNA靶向Cyclin D2诱导成年猪心肌细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞亚群重获新生特征的单核RNA测序分析

《Biomolecules》：Single-Nuclei RNA Sequencing Data Analysis: Cardiomyocyte-Specific Modified-RNA Targeting Cyclin D2 Turns Subpopulations of Adult Pig Cardiomyocytes, Fibroblasts, and Smooth Muscle Cells Back toNeonatal Characteristics

　　

摘要：自然条件下，猪心脏无法从缺血再灌注损伤中恢复；然而，接受心肌细胞特异性修饰RNA（CM-SMRTs）靶向Cyclin D2（CCND2CM-SMRTs）处理的猪心脏，与接受绿色荧光蛋白诱导的修饰RNA（GFPCM-SMRTs）处理的未治疗心脏相比，显示出显著改善的心脏功能。在本报告中，研究人员生成并分析了单核RNA测序（snRNAseq）数据，以探究CCND2CM-SMRTs调控心肌细胞周期并改善整体心脏功能的机制。将来自CCND2CM-SMRTs处理猪心脏（约2月龄）的snRNAseq数据与年龄匹配的GFPCM-SMRTs处理心脏的数据（分别在处理后第2天和第28天采集）以及具有再生潜能的出生后第1天和第2天（na?ve neonatal day 1 and 2）和不具再生潜能的2月龄（na?ve 2-month-old）对照组数据进行整合。所有心脏细胞类型的snRNAseq数据均使用自动编码器（Autoencoder）流程进行分析。定义了六种心肌细胞亚群（CM1–CM6）、四种成纤维细胞亚群（FB1–FB4）、六种平滑肌细胞亚群（SMC1–SMC4）、五种内皮细胞亚群（EC1–EC5）、四种巨噬细胞亚群（Mph1–Mph4）和两种T细胞亚群（Tcell1和Tcell2）。虽然CCND2作为驱动细胞周期从G1期进入S期的主要因子而广为人知，但snRNAseq数据并未显示CCND2CM-SMRTs处理组与GFPCM-SMRTs处理组在第2天的细胞周期活性存在任何显著差异。相反，在新生猪心脏以及CCND2CM-SMRT处理心脏损伤边缘区（即递送CM-SMRTs的区域）中观察到了CM1、FB1和SMC1亚群，这些亚群出现在处理后第2天；而这些亚群并未出现在任何未受缺血再灌注和CM-SMRTs影响的远隔区域，也未出现在任何未经处理和对照组心脏中。细胞间通讯分析揭示，CM1可能通过骨形态发生蛋白（BMP）和血小板衍生生长因子（PDGF）信号通路影响其他非心肌细胞亚群。因此，该分析表明CCND2CM-SMRTs可能驱动一部分猪心脏细胞朝向新生状态转变，在此状态下猪心脏仍保留再生能力。

一、研究背景与目的

心力衰竭是全球范围内导致死亡的主要原因之一，其核心病理环节在于大量心肌细胞（CMs）死亡后心脏收缩功能丧失。哺乳动物的心肌细胞在出生后不久便退出细胞周期，因此在成年个体中无法通过自然增殖来响应损伤。尽管已有研究表明，通过过表达细胞周期调节因子有可能重新激活成年哺乳动物心肌细胞的增殖，但其具体分子机制尚未被充分阐明。Cyclin D2（CCND2）作为细胞周期从G1期向S期转换的关键驱动因子，在体外实验中已被证实可增加人诱导多能干细胞来源的心肌细胞的增殖。然而，在体内，虽然研究人员前期工作发现，利用心肌细胞特异性修饰RNA（CM-SMRTs）在成年猪心脏中过表达CCND2（^CCND2CM-SMRTs）能够显著促进心肌细胞增殖并改善缺血再灌注（I/R）损伤后的心功能，但其作用的中间机制——究竟是直接驱动细胞周期进程，还是通过改变心肌细胞的成熟状态来实现——尚不清楚。鉴于新生猪心脏在出生后第1天和第2天（P1和P2）仍保留再生能力，研究人员提出假说：^CCND2CM-SMRTs可能通过驱使成年猪心脏细胞（尤其是心肌细胞）获得新生特征来发挥其促增殖和修复作用。本研究旨在通过生成并分析单核RNA测序（snRNAseq）数据，系统性地检验这一假说。

二、关键技术方法

研究人员对来自约2月龄猪心脏的snRNAseq数据进行了分析。样本包括：接受^CCND2CM-SMRTs或对照^GFPCM-SMRTs处理并在处理后第2天（D2）和第28天（D28）取材的心脏组织，同时整合了具有再生能力的出生后第1天和第2天（CTL-P1+2）以及不具再生能力的2月龄（CTL-P56）对照组猪心脏的公开数据。实验涉及缺血再灌注损伤模型的建立及心肌内注射给药。主要技术方法包括：利用Cell Ranger软件进行数据预处理和比对至猪参考基因组（Sscrofa11.1）；采用DoubletFinder去除双细胞；运用Seurat R包和自动编码器（Autoencoder）流程进行数据整合、降维、聚类和细胞类型鉴定；通过Seurat细胞周期评分和细胞周期特异性Autoencoder评估细胞周期状态；使用Monocle工具包进行细胞轨迹分析；应用CellChat工具包分析不同细胞类型间的配体-受体介导的细胞间通讯。

三、主要研究结果

3.1 从snRNAseq数据中鉴定出五种心脏细胞类型

通过对来自^CCND2CM-SMRTs和^GFPCM-SMRTs处理心脏（含损伤边缘区BZ和远隔区RZ）的219,783个细胞核，并与新生及成年对照组数据整合（共254,029个细胞核），经Autoencoder处理后，成功区分出五种主要心脏细胞类型：心肌细胞（标记为TNNT2和MYH7）、成纤维细胞（标记为COL1A1和COL1A2）、内皮细胞（标记为PECAM1和KDR）、平滑肌细胞（标记为ACTA2和MYH11）以及免疫细胞（标记为CD163和CD3E）。

3.2 大量^CCND2CM-SMRTs处理的心肌细胞呈现新生P1&2转录组特征

对145,417个心肌细胞核进行二次Autoencoder分析，定义了六个心肌细胞亚群（CM1-CM6）。其中，CM1由超过95%的新生（CTL-P1+2）心肌细胞组成，但在成年（CTL-P56）和^GFPCM-SMRTs处理组中完全缺失。值得注意的是，仅在^CCND2CM-SMRTs处理组D2的BZ区域出现了约40%的CM1细胞。CM1高表达促进心肌细胞增殖的正向调节因子（如BMP7、ERBB4、HSPA5），并上调氧化磷酸化等代谢通路，与新生心肌细胞特征一致。相反，代表成熟心肌细胞的CM2（富含肌膜、肌节组装通路）仅在CTL-P56中出现。代表损伤应答的CM3在D2的BZ比例最高，随后下降。令人意外的是，细胞周期特异性分析（Seurat评分和Autoencoder）均未发现^CCND2CM-SMRTs与^GFPCM-SMRTs组在细胞周期阶段分布或增殖标志物共定位方面存在显著差异。轨迹分析提示，CM3可能是连接成年心肌细胞（CM2/CM4）与新生心肌细胞（CM1）及I/R后心肌细胞（CM5/CM6）的中间状态，而^CCND2CM-SMRTs可能促使CM3向新生方向（CM1）分化。

3.3 部分^CCND2CM-SMRTs处理的成纤维细胞呈现新生P1&2转录组特征

对48,632个成纤维细胞核的分析定义了四个亚群（FB1-FB4）。FB1主要由约90%的新生（CTL-P1+2）成纤维细胞构成，高表达胶原家族基因及血管生成正调控通路。同样地，FB1也特异性地出现在^CCND2CM-SMRTs处理组D2的BZ区域（约占20%），而在其他组中未见。代表增殖性成纤维细胞的FB2在^GFPCM-SMRTs组BZ的比例（40.58%）显著高于^CCND2CM-SMRTs组（25.61%），这与后者减少纤维化的表型一致。轨迹分析表明FB1直接与成年成纤维细胞（FB4）相连，而非源自增殖性前体。

3.4 少量^CCND2CM-SMRTs处理的平滑肌细胞呈现新生P1&2转录组特征

对9,764个平滑肌细胞核的分析定义了六个亚群（SMC1-SMC6）。SMC1包含约60%的新生（CTL-P1+2）平滑肌细胞，并上调细胞分裂和DNA修复通路。同样，SMC1也仅在^CCND2CM-SMRTs处理组D2的BZ区域出现（约10%）。此外，^CCND2CM-SMRTs处理有助于维持代表成熟状态的SMC2亚群的稳定，而^GFPCM-SMRTs组则出现炎症相关SMC3亚群的富集。

3.5 ^CCND2CM-SMRTs和^GFPCM-SMRTs处理后内皮细胞的异质性

对26,446个内皮细胞核的分析定义了五个亚群（EC1-EC5），其中EC3为淋巴管内皮细胞。EC1仅在^CCND2CM-SMRTs处理组D28中出现，并上调RNA剪接因子。EC2主要存在于新生心脏，高表达内皮-间充质转化标志物PDGFRA及TGFβ信号通路，与再生心脏中的内皮细胞亚群一致。

3.6 ^CCND2CM-SMRTs和^GFPCM-SMRTs处理后免疫细胞的异质性

对23,770个免疫细胞核的分析定义了四个巨噬细胞亚群（Mph1-Mph4）和两个T细胞亚群（Tcell1-Tcell2）。总体而言，^CCND2CM-SMRTs处理组的免疫细胞比例低于^GFPCM-SMRTs组。Mph1仅见于新生心脏，呈增殖性特征；Mph2仅在I/R后D2的BZ出现，富集吞噬体通路。T细胞亚群在各组中均有分布，但^CCND2CM-SMRTs组的T细胞比例较低。

3.7 细胞间通讯分析表明CM1可能通过BMP和PDGF信号与其他非心肌细胞亚群相互作用

由于^CCND2CM-SMRTs仅特异性作用于心肌细胞，因此非心肌细胞的变化很可能是由CM1介导的细胞间通讯所致。CellChat分析揭示，CM1主要通过BMP和PDGF信号通路与其他细胞亚群通信。具体而言，CM1高度上调配体BMP7和PDGFD。BMP7可与内皮细胞EC1和成纤维细胞FB2上的受体ACVR2A以及成纤维细胞FB1上的受体BMPR1A相互作用；PDGFD则与平滑肌细胞SMC1上的受体复合物相互作用，下游富集了胚胎发育等通路。

四、讨论与结论

讨论部分指出，尽管CCND2已知是G1/S期转换的驱动因子，但本研究的细胞周期特异性分析并未在^CCND2CM-SMRTs处理组观察到预期的细胞周期阶段显著变化或增殖标志物共定位现象。这提示，CCND2促进心肌细胞增殖的中间机制并非直接增强G1/S期进展，而是可能通过“拨回时钟”的方式，使细胞去成熟化，获得新生或胚胎样特征。snRNAseq数据中CM1亚群的出现及其与新生细胞的转录组重叠有力地支持了这一观点。此外，在成纤维细胞（FB1）和平滑肌细胞（SMC1）中也观察到了类似的向新生状态转变的现象，并且细胞间通讯分析表明，这种非心肌细胞的变化是由过表达CCND2的心肌细胞（CM1）通过分泌BMP和PDGF信号分子所驱动的。

研究结论部分明确指出：对^CCND2CM-SMRTs处理心脏的snRNAseq分析表明，^CCND2CM-SMRTs的作用机制涉及心脏（包括心肌细胞和非心肌细胞）的成熟度调控。