经典霍奇金淋巴瘤（cHL）的分子图谱与生物学分型：从复发性遗传病变、EBV驱动机制到肿瘤微环境及ctDNA/单细胞解析

《Prosthesis》：Molecular Landscape of Classical Hodgkin Lymphoma: From Genetic Lesions to Biologically Defined Subtypes

霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）是一种独特的淋巴系统恶性肿瘤，其特征是罕见的恶性Hodgkin和Reed–Sternberg（HRS）细胞镶嵌于高度复杂且具有免疫活性的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中。过去十年，基因组学和转录组学技术的进展显著提升了对HL发病机制（pathogenesis）的认识。影响关键致癌通路的复发性遗传改变，包括核因子κB（NF-κB）、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路，与广泛的免疫逃逸（immune evasion）机制协同作用，维持肿瘤细胞存活和增殖。Epstein–Barr病毒（Epstein–Barr virus, EBV）感染在相当一部分病例中通过提供替代性生存信号、调节免疫相互作用以及通过潜伏膜蛋白1（LMP1）靶向端粒-端粒保护蛋白复合体（telomere-shelterin complex），参与淋巴瘤发生（lymphomagenesis）。与此同时，新出现的证据强调了肿瘤微环境的核心作用，其通过直接细胞相互作用、细胞因子信号传导以及代谢和免疫调节机制，积极支持恶性细胞生长。近期采用循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）分析和单细胞方法的研究，使非侵入性基因组表征成为可能，并揭示了生物学上不同的分子亚群，进一步强调了肿瘤遗传学与免疫背景（immune contexture）之间的相互作用。这些认识正在重塑疾病分类，并为生物标志物驱动的治疗策略开辟新途径。更深入地整合分子、免疫和微环境特征，对于优化风险分层（risk stratification）以及为HL患者开发更精准、毒性更低的治疗至关重要。

1. Introduction（引言）
霍奇金淋巴瘤（HL）是西方常见淋巴瘤之一，年发病率约每10万人3例，呈双峰年龄分布，20—30岁和50—70岁为高峰。EBV感染与约25—40%的HL相关，老年患者中更常见；自身免疫病和HIV感染等免疫缺陷状态亦为风险因素。HL分为经典霍奇金淋巴瘤（cHL）和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤（NLPHL）。cHL以Hodgkin/Reed–Sternberg（HRS）细胞为特征，这类细胞为B细胞来源，免疫表型上一致表达CD30，常表达CD15（75—80%），约95%病例弱表达PAX5，少数病例表达CD20（至多20%）。世界卫生组织造血淋巴肿瘤分类第5版（WHO-HAEM5）和国际共识分类（ICC）均保留cHL的四个组织学亚型：结节硬化型（NSCHL）、混合细胞型（MCCHL）、富淋巴细胞型（LRCHL）和淋巴细胞消减型（LDCHL）。临床多表现为无痛性浅表淋巴结肿大，常累及颈部和锁骨上区，纵隔受累约60%，大包块病变20—25%，约30—40%患者出现B症状。治疗已引入PET适应策略、抗CD30抗体–药物偶联物brentuximab vedotin（BV）及PD-1检查点抑制剂nivolumab和pembrolizumab，治愈率接近90%，当前更关注去强化治疗和降低毒性。cHL组织构成特殊，HRS细胞仅占1—5%，周围为T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和基质成分等构成的异质微环境。HRS细胞稀少长期限制分子分析，激光捕获显微切割、流式分选、FACS富集、全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）及ctDNA分析逐步拓展了对其生物学的认识。

2. Cellular Origin of HRS Cells（HRS细胞的细胞起源）
对分离HRS细胞的分子分析显示，其免疫球蛋白（Ig）基因存在克隆性重排和体细胞突变，提示cHL起源于生发中心（GC）B细胞。约四分之一病例中，Ig基因携带破坏性突变，导致功能性B细胞受体（BCR）表达缺失；此类细胞在生理条件下应发生凋亡，但HRS前体细胞获得额外转化事件而存活。EBV阳性病例中，LMP1和LMP2A可分别提供类似CD40和BCR的替代生存信号，从而挽救BCR缺陷的GC B细胞。LMP1在EBV阴性HL细胞系L-428中表达与多核RS细胞形态形成相关。HRS细胞还经历广泛转录重编程，B细胞基因表达程序近乎沉默，机制涉及OCT2、PU.1和BOB1等B细胞特异性转录因子表达降低，ID2、ABF1、NOTCH1和STAT5等转录抑制因子异常激活，以及B细胞相关基因的表观遗传沉默。罕见T细胞来源病例已有报道，但综合Ig和T细胞受体（TCR）基因重排及淋巴瘤相关突变分析提示，部分最初归类为cHL的病例实为伴HRS样细胞的T细胞淋巴瘤。

3. Genetic Lesions in HRS Cells（HRS细胞中的遗传病变）
cHL遗传发病机制以复发性染色体改变和体细胞突变影响关键信号网络为特征。NF-κB通路组成性激活是核心致癌机制，可由NFKBIA、NFKBIE、TNFAIP3和CYLD等负调控因子失活突变，以及REL和MAP3K14等正调控成分基因组增益或扩增引起，涉及经典和非经典NF-κB信号，维持肿瘤细胞存活、增殖、细胞因子产生和抗凋亡。JAK/STAT信号异常是另一标志，涉及SOCS1和PTPN1等抑制因子突变、JAK2拷贝数增益（约40%病例）以及STAT6激活突变或增益，导致STAT组成性激活。XPO1激活突变约见于20—25%的cHL，可促进STAT蛋白核积累，E571K热点突变与较差无进展生存期（PFS）趋势相关。染色体9p24.1扩增常同时靶向PD-L1、PD-L2和JAK2，将致癌信号与免疫逃逸功能相连。PI3K/AKT和G蛋白偶联受体（GPCR）信号亦受累，包括GNA13突变和ITPKB遗传病变，增强AKT激活、代谢适应和HRS细胞存活。免疫逃逸相关遗传改变包括MHC I类分子表达降低或缺失，常由β₂-微球蛋白（B2M）突变引起，以及CIITA重排等MHC II类转录机制异常，并常伴PD-L1/PD-L2过表达，损害细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞识别。TP53突变见于约5—10%患者，与基因组不稳定和更高突变负荷相关。

4. Genetic Clusters in HL（HL中的遗传聚类）
ctDNA测序使较大规模cHL队列的基因组分析成为可能。Alig等基于293例患者的体细胞突变和拷贝数改变进行无监督分析，识别出H1和H2两个分子亚型。H1（68%）具有高单核苷酸变异负荷，富集经典NF-κB（TNFAIP3、B2M）、JAK/STAT（SOCS1、STAT6、CSF2RB）和PI3K信号改变，并呈细胞因子驱动的肿瘤–微环境相互作用特征。H2（32%）体细胞拷贝数改变负荷更高，常见TP53和KMT2D突变及染色体不稳定，富集EBV阳性和混合细胞型病例，多见于老年和男性患者，基线ctDNA水平更高，PFS更差。另一项前瞻性ctDNA测序分析提出三种生物学亚型：炎症免疫逃逸型（44.7%）、病毒驱动型（23.0%）和致癌基因驱动型（32.3%）。炎症免疫逃逸型常见9p24.1高水平扩增，累及PD-L1/PD-L2位点，微环境富集B细胞、滤泡辅助T细胞和调节性T细胞（Treg）；病毒驱动型肿瘤突变负荷（TMB）低，常见EBV和/或HHV-6阳性，微环境富集巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和CD8⁺T细胞；致癌基因驱动型TMB最高，常见TNFAIP3、ITPKB、SOCS1和B2M突变，微环境相对免疫冷，PFS最好，而炎症免疫逃逸型复发风险最高。进一步ctDNA研究显示cHL分子分类主要由基因组不稳定机制驱动，识别出C0（2%）、C1（63%）和C2（35%）；C1为超突变型，伴激活诱导胞苷脱氨酶（AID）相关突变特征、微卫星不稳定性（MSI）相关特征、预测新抗原负荷增加和全基因组倍增（WGD）；C2以染色体不稳定和体细胞拷贝数改变负荷为主。C1和C2共享STAT6突变及2p/2p16.1和9p/9p24.2增益等cHL标志性病变。非编码调控突变亦高度常见（83%），BCL6内含子超级增强子突变约见于31%患者。Aoki等基于纯化HRS细胞、空间转录组学和成像质谱流式提出HLGen分类，包括CST、CN913、STB和CN2P四个亚型：CST由CSF2RB/TNFAIP3突变定义，伴异常STAT5信号和FOXP3⁺Treg、CCR4⁺CD4⁺T细胞富集；CN913伴9p24.1扩增和13q缺失，富集EBV阳性、干扰素和NF-κB信号，微环境富集LAG3⁺CD4⁺T细胞和PD-L1⁺巨噬细胞；STB伴STAT6/B2M改变、TGF-β信号激活和免疫冷表型；CN2P多见于老年患者，伴DNA损伤应答和TP53相关通路激活，并富集PD-1⁺CD4⁺T细胞。

5. Role of EBV in HL Pathogenesis（EBV在HL发病机制中的作用）
EBV与cHL的关联随地域、年龄和组织学亚型而变化。美国和欧洲约30—50%的cHL为EBV阳性，越南、肯尼亚和洪都拉斯等一些发展中国家可接近100%。EBV阳性cHL更常见于儿童（<10岁）和老年人（>60岁），并与混合细胞型密切相关。EBV与生发中心的相互作用可能是EBV相关淋巴瘤发生的重要环节。EBV感染B细胞可在GC中保留BCL6和AID等GC相关标志；体外EBV感染人B细胞可诱导早期DNA损伤应答和与端粒功能障碍相关的结构染色体异常。EBV阳性HRS细胞通常表达EBV核抗原1（EBNA1）、LMP1和LMP2A。EBNA1对病毒基因组复制和维持至关重要。LMP1的胞质结构域可功能性模拟组成性CD40信号，激活NF-κB和PI3K/AKT/mTOR等下游通路，并可通过STAT转录因子诱导PD-L1表达。LMP1还可通过破坏端粒稳态促进多核RS细胞表型：从单核Hodgkin细胞向多核RS细胞转变与端粒功能障碍和端粒聚集相关；LMP1下调端粒保护蛋白TRF1、TRF2和POT1，恢复TRF2可阻止LMP1诱导的多核化。LMP2A含模拟紧张性BCR信号的基序，可维持GC B细胞存活。人源化小鼠模型中，EBNA2缺失EBV株P3HR1可产生Hodgkin样淋巴瘤，伴LMP1高表达II型潜伏程序。EBV阳性病例较少携带TNFAIP3和NFKBIA等NF-κB通路基因突变，提示病毒信号可部分替代遗传改变。

6. Tumor Microenvironment（肿瘤微环境）
cHL的一个定义性特征是高度组织化且功能动态的肿瘤微环境，其是肿瘤组织的主要细胞成分，对HRS细胞存活和扩增至关重要。HRS细胞周围浸润包括CD4⁺辅助性和调节性T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、成纤维细胞和内皮成分。CD4⁺T细胞通常占优势，并常围绕HRS细胞形成紧密聚集，即花环现象；该接触由HRS细胞上的CD54与T细胞上的CD11a/CD18等黏附分子，以及CD40–CD40L和CD80/CD86–CD28等共刺激受体–配体对介导。肥大细胞和嗜酸性粒细胞表达的CD30配体可激活HRS细胞CD30信号。HRS细胞通过分泌细胞因子和趋化因子塑造支持性生态位，如CCL5、CCL17（TARC）、CCL20、CCL22和CCL28促进T辅助细胞、Treg、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润，并参与基质重塑和血管生成。免疫逃逸是cHL微环境的核心功能维度，HRS细胞可通过MHC I类分子下调、PD-L1、PD-L2、CD95L、HLA-E和HLA-G等抑制性配体表达，以及IL-10、TGF-β、巨噬细胞迁移抑制因子和galectin-1等免疫抑制性细胞因子分泌逃避细胞毒监视。FOXP3⁺和LAG-3⁺Treg募集、肿瘤相关巨噬细胞极化、PD-L1表达及吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）介导的色氨酸耗竭进一步抑制CD8⁺T细胞和NK细胞功能；CD38、CD39和CD73驱动的嘌呤能信号亦强化免疫抑制。近期研究还强调基质区室，尤其是癌症相关成纤维细胞（CAFs）。Leivonen等通过多重免疫荧光和空间单细胞分析显示，总体CAF丰度较高与较好PFS独立相关，而PDGFRB⁺CAFs靠近HRS细胞则预测较差PFS和总生存期（OS）。

7. Conclusions（结论）
HL是一种独特的B细胞恶性肿瘤模型，其生物学身份由细胞起源、遗传病变和复杂肿瘤微环境之间的相互作用塑造。尽管恶性HRS细胞仅占肿瘤质量的一小部分，但影响NF-κB、JAK/STAT和PI3K/AKT等关键信号通路的复发性遗传改变以及免疫逃逸机制共同驱动淋巴瘤发生和持续存在。同时，广泛的转录重编程导致B细胞表型丢失，提示表观遗传和调控机制在定义HRS细胞身份中具有重要作用。高通量测序技术的进展显著拓展了对cHL基因组结构及其生物学意义分子亚型的认识。这些生物学洞见正日益影响治疗策略：PD-1阻断和CD30靶向治疗的有效性凸显了免疫逃逸和HRS细胞脆弱性的临床相关性，新兴分子见解可能支持更靶向和个体化的治疗。持续整合基因组、免疫学和微环境信息，对于完善生物学分类、识别新的治疗脆弱点并最终实现更精准、低毒的治疗策略至关重要。